β-酪啡肽-7通过增强Foxo1表达及核易位对人晶状体上皮细胞氧化损伤的保护作用

发布时间：2020-05-23 06:31

【摘要】：目的研究高糖诱导人晶状体上皮细胞(HLECs)氧化应激过程,并探讨β-酪啡肽-7(β-CM-7)在人晶状体上皮细胞氧化应激中的作用及可能机制。方法1、首先应用MTT实验测定不同浓度的葡萄糖对细胞活力的影响,并筛选出与正常葡萄糖浓度最有统计学意义的葡萄糖浓度组成为高糖组(本实验我们把mmol/L简写为m M),用MTT实验测定不同浓度的β-CM-7对HLECs活力的影响,并筛选出与之前选择的高糖组最有统计学意义的浓度组作为β-CM-7组;免疫印迹(Western blot)实验检测4个浓度:5m M、10m M、20m M和40m M的葡萄糖对细胞内Foxo1和Sp1表达的影响。2、按照处理方式不同分为5组:正常对照组:5m M(control);高糖组:40m M(HG);β-CM-7组:β-CM-7(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)。应用流式细胞术测定氧化应激诱导的活性氧(ROS)含量;生物酶测定试剂盒测定丙二醛(MDA)和抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)含量;Western blot和免疫荧光实验来确定Foxo1、Sp1和下游相关蛋白GSH-px在分子生物学水平上的表达,Foxo1和Sp1在细胞内的定位。结果1、细胞经不同浓度葡萄糖处理后,HLECs活力随葡萄糖浓度增加而降低(P㩳0.01),与正常葡萄糖浓度相比,葡萄糖浓度为40m M时,统计学意义最显著(P㩳0.01),在葡萄糖浓度为50m M时,细胞不可逆死亡;Western blot结果显示,在当葡萄糖浓度由5m M增高至40m M时,HLECs的Foxo1、Sp1表达逐渐均减低(P㩳0.01);2、当用β-CM-7(10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L)预处理后,再用高糖(40m M)处理细胞,与正常对照组相比细胞活力增强(P㩳0.01);与高糖组相比,β-CM-7组ROS、MDA均含量降低(P㩳0.01),SOD表达增高(P㩳0.01);Western blot结果显示,与高糖组相比,β-CM-7组(10-5mol/L)细胞内总Foxo1表达量升高(P㩳0.01),Foxo1转移至细胞核,细胞核内的Foxo1表达量增加(P㩳0.01),细胞质内的Foxo1表达量降低(P㩳0.01),GSH-Px的表达量增加(P㩳0.01)。免疫荧光可以观察到与正常对照组相比,高糖组中的Foxo1和Sp1表达非常弱。而细胞用β-CM-7(10-5mol/L)预处理后,Foxo1表达总量高于高糖组,并转移到细胞核内,Sp1在细胞核中表达随Foxo1转移到细胞核内而变强。结论1、高浓度葡萄糖降低HLECs活力,增加氧化酶含量,降低抗氧化酶含量,降低Foxo1和Sp1的相对表达。2、β-CM-7通过上调Foxo1的相对表达和促进Foxo1核易位来保护HLECs免受氧化损伤。
【图文】：

细胞活力

（二）β-CM-7 预处理对细胞活力的影响通过 MTT 法筛选β-CM-7 的浓度，与 5mM (control）组相比，40mM (HG)组细胞活力降低（P=0.004）；与 40mM (HG)相比，β-CM-7 组（10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L）细胞活力增强（P=0.003、P=0.000、P=0.000、P=0.008），β-CM-7 组（10-8mol/L）与 40mM (HG)组相比，没有差异（P=0.061），而β-CM-7 组（10-4mol/L）与β-CM-7 组（10-5mol/L）相比，没有差异（P=0.056）。如图 1。

灰度值,流式细胞术

图 2 Foxo1 和 Sp1 的相对表达及灰度值分析注：Foxo1 的表达量与 5mM(control)组相比，＃P＜0.01；Sp1 的表达量与 5mM(control)组相比，，＊P＜0.01。三、流式细胞术对细胞内 ROS 的检测流式细胞术测定细胞在不同处理方式下产生的 ROS 含量，不同组间相比有差异（F=458.24, P=0.000）；与正常对照组相比，高糖组产生的 ROS 显着增多（P=0.004）；当细胞经过不同浓度β-CM-7 预处理后，与高糖组相比，β-CM-7组（10-5mol/L、10-6mol/L、10-7mol/L）ROS 水平降低（P=0.000、P=0.008、P=0.002）；β-CM-7 三组间比较：与β-CM-7 组（10-5mol/L）相比，β-CM-7 组（10-6mol/L、10-7mol/L）ROS 水平升高（P=0.010、P=0.016）；与β-CM-7 组（10-6mol/L）相比，β-CM-7 组（10-7mol/L）ROS 水平升高（P=0.032）。如图3、表 1。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R776.1

【参考文献】