miRNA-17-5p对湿性AMD患者抗VEGF治疗的作用及机制研究

发布时间：2020-05-29 17:34

【摘要】：目的:观察湿性年龄相关性黄斑变性(AMD)患者抗新生血管内皮生长因子(VEGF)药物治疗后房水中微小RNA(miRNA)水平改变,并探讨其与预后的相关性及可能的作用机制。方法:1、选取20例(20眼)湿性AMD患者,签署知情同意书。分别在第一次、第二次行玻璃体腔注射抗VEGF药物时抽取约50ul房水,通过mi RNA衍生片段长度多肽性(miRFLP)直接测定法检测房水中16种可能相关的miRNA水平,分析抗VEGF治疗前后mi RNA水平变化,筛选出有规律变化的miRNA种类,然后比较其与中心视网膜厚度(CMT)变化的相关性。2、采用HUVEC细胞,将与CMT有相关性的miRNA过表达,检测细胞表达的目的基因及蛋白的水平,探讨可能的作用机制。通过TargetScan算法分析该miRNA的潜在靶点,将预测出的靶基因与血管生成强相关的TGF-β家族进行交叉对比,选出实验的目的基因及蛋白。实验分为药物对照组、miRNA mimic组、mimic阴性对照组。通过qRT-PCR检测细胞转染效率以确定实验转染浓度。通过CCK8检测细胞活性以确定实验转染时间。采用上述转染浓度及转染时间进行实验。通过qRT-PCR及Western Blot检测各组目的基因及蛋白的表达水平。结果:1、筛选出抗VEGF治疗前后房水miRNA变化有统计学意义的miR-17-5p(t=-4.134,P=0.001)及miR-146a(t=-4.566,P=0.000);治疗前后房水中miRNA表达量改变与CMT改变的Spearman相关性分析结果显示:miR-17-5p(r=-0.528,P=0.017),miR-146a(r=0.226,P=0.339)。2、选出的靶基因为TGF-β_2和GDF11。qRT-PCR结果显示:miRNA(miR-17-5p)最佳转染浓度为50nM。CCK8结果显示:miRNA(miR-17-5p)最佳转染时间为24h。qRT-PCR结果显示:与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的TGF-β_2表达水平明显下降(t=26.669,P=0.001),mimic阴性对照组的表达水平无明显变化(t=0.956,P=0.440);与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的GDF11表达水平明显上升(t=-3.357,P=0.028),mimic阴性对照组的表达水平无明显变化(t=-1.420,P=0.292)。Western Blot结果显示:与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的TGF-β2表达量明显下降(t=13.046,P=0.000),mimic阴性对照组的表达量无明显变化(t=-0.559,P=0.632);与药物对照组相比,miRNA(miR-17-5p)mimic组的GDF11表达量明显上升(t=-21.714,P=0.002),mimic阴性对照组的表达量无明显变化(t=0.674,P=0.537)。结论:1、抗VEGF药物治疗后,患者房水中mi RNA-17-5p表达量与黄斑结构改善正相关。2、上调miRNA-17-5p可能通过抑制TGF-β_2、促进GDF11的表达,进而参与到抗VEGF治疗的“应答”过程。
【图文】：

形态图,体外培养,单层,细胞

1 体外培养的 HUVEC 细胞，单层贴壁生长，大小形态较一致。R 检测 miR-17-5p 转染效率实验效果，向 HUVEC 细胞转染不同浓度（对照组、50nic，分别于 24h、48h 后收集细胞。qRT-PCR 结果示，随后 miR-17-5p 的相对表达水平分别为（1.00±0.00）、（56）；48h 后 miR-17-5p 的相对表达水平分别为（1.00±0.073±11.27）。24h 与 48h 相对应转染浓度的转染效率差异00nM 的转染效率也无显著差异（P＞0.05）。因此，，本实ic 及其阴性对照的处理浓度，继续后续实验。检测（CCK8）胞经贝伐单抗、miR-17-5pmimic（50nM）及其阴性对照（已额外设置不对细胞做任何处理的空白对照组），相对24h 各组分别与其相应空白对照组相比，差异无统计学意其相应空白对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。

转染,实验组,青岛大学,硕士学位论文

青岛大学硕士学位论文TGF-β2的 mRNA 表达量在 miR-17-5p mimic 组明显下降，有统计学差异(t=26.669,P=0.001）；在 mimic 阴性对照组差异无统计学意义(t=0.956,P=0.440）；GDF11 的 mRNA 表达量在 miR-17-5p mimic 组明显上升，有统计学差异(t=-3.357,P=0.028）；在 mimic 阴性对照组差异无统计学意义(t=-1.420,P=0.292）。具体见图 2。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R774.5

【参考文献】