PFKFB3在高糖环境下对人脐静脉内皮细胞的作用及机制研究

发布时间：2020-05-30 19:34

【摘要】：目的:作为糖尿病性视网膜病变分级的重要标志性特征,新生血管是整个DR发展中的关键性事件,大量研究发现血管内皮细胞依靠无氧糖酵解产生能量来维持细胞功能,即形成“分支”,产生新生血管。但高血糖环境下内皮细胞糖酵解对新生血管的作用机制仍不清楚,本研究将探讨磷酸果糖激酶-2/果糖-2,6-二磷酸酶3(phospofructokinase-2/fructose-2,6-bisphosphatase 3,PFKFB3)在高糖环境下对血管新生的可能作用及其机制。方法:研究主要分为五个部分:第一部分采用正常糖(5 mmol/L glucose,NG)和高糖(30 mmol/L glucose,HG)分别培养人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVECs)24 h后,采用免疫印迹实验(Western Blot,WB)和实时聚合酶链式反应(real-time polymerase chain reaction,RT-PCR)检测正常糖和高糖环境下PFKFB3的表达;第二部分采用正常糖(5 mmol/L glucose,NG)、正常糖加SiRNA-1(NG+SiRNA-1)、正常糖加SiRNA-2(NG+SiRNA-2)和正常糖加SiRNA-3(NG+SiRNA-3)转染HUVECs后,继续培养24 h,采用WB方法检测每组中PFKFB3的表达。第三部分采用正常糖(NG)、正常糖加SiRNA(NG+SiRNA)、高糖(HG)和高糖加SiRNA(HG+SiRNA)培养HUVECs后,分别将每组中的HUVECs加入对应的基质胶中继续培养,对每个孔进行照相,最后采用ImageJ angiogenesis软件对每组进行管腔形成能力检测。第四部分采用正常糖(NG)和正常糖加SiRNA(NG+SiRNA)培养HUVECs,采用WB方法检测磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylation Protein kinase B,pAkt)及蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB or Akt)的表达。第五部分采用正常糖(NG)、高糖(HG)和高糖加SiRNA(HG+SiRNA)培养HUVECs,采用WB方法检测pAkt及Akt的表达。结果:第一部分高糖培养基培养的HUVECs相较于正常糖环境下的PFKFB3蛋白表达明显升高(t=5.457,P=0.000,P0.01),且高糖培养基培养的HUVECs相较于正常糖环境下的PFKFB3 mRNA表达也明显升高(t=4.466,P=0.000,P0.01);第二部分SiRNA-1对于PFKFB3的抑制效果最为明显,差异具有统计学意义(P=0.000,P0.01);第三部分高糖培养基培养的HUVECs的管腔形成能力是明显低于正常对照组的(P=0.005,P0.01),正常糖加入SiRNA的管腔形成能力相较于对照组来说也是明显升高的(P=0.031,P0.05),高糖培养基中加入SiRNA的管腔形成能力相较于单纯高糖培养基的管腔形成能力是明显增加的(P=0.041,P0.05),正常对照组与高糖培养基中加入SiRNA相比较则没有明显差异(P=0.173,P0.05);第四部分正常糖培养基中加入SiRNA抑制PFKFB3后,HUVECs的pAkt的表达量相较于单纯正常糖培养基中明显减少(t=16.91,P=0.00,P0.01);第五部分正常糖培养基组中的pAkt表达明显高于高糖培养基组(P=0.004,P0.01),高糖培养基加入SiRNA组中pAkt表达明显高于高糖培养基组(P=0.000,P0.01),当高糖培养基中加入SiRNA时pAkt表达则明显高于正常糖培养基组(P=0.008,P0.01)。结论:抑制PFKFB3可以明显减轻高糖环境诱导的病理性新生血管,明显提高因高糖环境降低的保护性因子pAkt的表达,从而起到保护HUVECs细胞的作用。PFKFB3有望作为防治因高糖环境诱导的新生血管的一个新靶点。
【图文】：

1 正常组与高糖环境下 PFKFB3 的表达：本研究正常传代 HUVECs，待细胞融合到 70%左右时开始用于实验，分别使用正常糖培养基及高糖培养基培养 HUVECs 48 h，分别进行 WesternBlot 及 RT-PVR 检测。Western Blot 检测结果显示：48 h 高糖培养基培养的HUVECs(1.514±0.1191，N=9)相较于正常糖环境下(1.00, N=9)的 PFKFB3明显升高，差异具有统计学意义(t=5.457, P=0.00, P<0.05)（图 1.）。RT-PCR检测结果提示：48h 高糖培养基培养的 HUVECs(1.350±0.083，N=5)相较于正常糖环境下的PFKFB3明显升高，差异具有统计学意义(t=4.466, P=0.00,P<0.05)（图 1.）

高糖培养基中加入 SiRNA 的管腔形成能力相较于单纯高糖培养基的是明显增加的(P=0.041, P<0.05)（图3.），，而正常对照组与高糖培养基中加入 SiRNA 相比较是没有明显差异的(P=0.173, P>0.05)（图 3.）。
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R774.1

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 孙韬;黄竹娟;苏宁;;高糖环境下不同浓度黄芩苷对人肾小管上皮细胞凋亡的影响[J];中国民族民间医药;2016年21期

2 刘玉芳;李兴;;高糖环境下脂联素对人肾小管上皮细胞转化生长因子-β_1表达的影响[J];临床医药实践;2009年04期

3 常颖;陈叙;;宫内暴露高糖环境与儿童肥胖的相关性分析[J];中国妇幼保健;2012年22期

4 张俊洁;李兴;;高糖环境下脂联素对人心肌细胞增殖的影响[J];中国现代药物应用;2012年04期

5 王保忠;;脂联素对高糖环境下人心肌细胞增殖及VEGF表达的影响[J];中国医药指南;2011年34期

6 李英;段惠军;张涛;张丽红;刘茂东;王秀芬;林琼真;;氟伐他汀对高糖环境中肾小球系膜细胞胞外信号调节激酶活性的影响[J];中华内分泌代谢杂志;2007年05期

7 李学刚;刘海英;柳刚;孙云;李娟;关广聚;;高糖环境对人肾小球系膜细胞表达结缔组织生长因子及其受体蛋白的影响[J];山东大学学报(医学版);2011年06期

8 任亚坤;周宏博;;肌肽对高糖环境下大鼠肾小球系膜细胞的保护作用[J];齐齐哈尔医学院学报;2008年08期

9 邓艳华;赵琳;刘冬梅;张宏利;刘建民;;急性高糖环境对大鼠骨形成的影响[J];诊断学理论与实践;2011年05期

10 付君静;吴小燕;;霉酚酸对高糖环境下肾小球系膜细胞外基质的影响[J];中国中西医结合肾病杂志;2008年11期

相关会议论文 前10条

1 叶帅;陈明卫;王佑民;陈燕;赵丽丽;;全长脂联素对高糖环境下结肠癌细胞增殖和凋亡影响的研究[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

2 黄荷凤;;宫内高糖环境对子代胰岛亲源性基因印记的影响及其遗传效应机制研究[A];2014浙江省计划生育与生殖医学学术年会暨“第七届生殖安全转化医学研讨会”论文汇编[C];2014年

3 丁国莲;王芳芳;黄荷凤;盛建中;;宫内高糖环境对子代胰岛亲源性基因印记的影响及其遗传效应机制研究[A];中华医学会第六次全国生殖医学学术会议专刊[C];2012年

4 夏广昊;刘静;郭茜;龚瑞;;高糖环境中人单核细胞和内皮细胞相互作用对MT1-MMP表达的影响[A];中华医学会第十二次全国内分泌学学术会议论文汇编[C];2013年

5 魏昕;张琳琳;黄震浩;郭桅;;罗格列酮对高糖环境下人脐静脉内皮细胞的作用研究[A];2013年全国医药学术交流会暨临床药学与药学服务研究进展培训班论文集[C];2013年

6 叶迅;洪郁芝;徐新鹏;;小鼠肾脏足细胞GPSD核心蛋白在高糖环境下表达的变化[A];2008年浙江省内分泌学学术会议论文汇编[C];2008年

7 程萌;陈德才;卢春燕;田浩明;魏松全;;高糖环境下MG63细胞的活性变化[A];中华医学会第四次全国骨质疏松和骨矿盐疾病学术会议论文汇编[C];2006年

8 牟姗;张庆怡;倪兆慧;;c-met对高糖环境人肾间质成纤维细胞PAI-1和Ⅲ型胶原活性的影响[A];2007年浙沪两地肾脏病学术年会资料汇编[C];2007年

9 詹聃婷;张云水;张慧;郭玲;;新型小分子RAGE抑制剂对高糖环境下牙周膜成纤维细胞增殖、修复和炎症反应影响的研究[A];第十一次全国口腔修复学学术会议论文汇编[C];2017年

10 夏广昊;刘静;马小琴;;高糖环境中单核细胞和内皮细胞黏附的影响[A];中华医学会糖尿病学分会第十六次全国学术会议论文集[C];2012年

相关博士学位论文 前10条

1 范可顺;丹参酮ⅡA对高糖环境中人视网膜血管内皮细胞体外生物学作用的研究[D];苏州大学;2018年

2 马莲环;Ang-(1-7)对高糖环境下足细胞线粒体miRNA-30a及其调控因子Drp1、P53的影响[D];山东大学;2019年

3 丁国莲;宫内高糖环境对子代亲源性基因印记的影响及其遗传效应机制的研究[D];浙江大学;2011年

4 蒋颖;宫内高糖环境对胎盘基因印记的影响及其遗传效应机制的研究[D];浙江大学;2013年

5 王媛媛;金雀异黄素对高糖环境足细胞自噬和炎症损伤的干预机制研究[D];河北医科大学;2015年

6 张倩;贝前列素钠对高糖损伤大鼠系膜细胞的保护作用及其机制研究[D];南方医科大学;2013年

7 王俊成;miR-467f对高糖环境下小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的调节机制研究[D];中国人民解放军医学院;2013年

8 邵s

本文编号：2688612