内外源性LXRs激动剂和DEX在LPS诱导的视网膜炎症反应中的作用及其机制的研究

发布时间：2020-05-31 03:49

【摘要】：背景炎症反应是机体对抗外来入侵物质的一种反应。在眼科领域,LPS诱导的人视网膜色素上皮细胞(RPE)的炎症与许多视网膜疾病的病理过程相关,包括葡萄膜炎、年龄相关性黄斑变性(AMD)、糖尿病视网膜病变(DR)。地塞米松(DEX)是一种糖皮质激素,具有很强的抗炎和免疫抑制作用,因此被广泛用于治疗眼部炎症性疾病。但长期运用地塞米松会导致系统和局部的副作用,因此寻找新的治疗视网膜炎症的药物靶点便成为研究热点。近年来,脂质代谢平衡与炎症的关系正成为新的研究热点。我们及其他实验室发现,脂质代谢关键受体肝脏X受体(LXRs)的外源性激动剂TO901317可抑制视网膜炎症并可能成为治疗视网膜炎症反应的一类新药。然而有报道提示内源性LXRs激动剂7-酮基胆固醇(7-KC)却能加重视网膜炎症反应。因此,我们提出疑问7-KC和TO90都是LXRs的激动剂,为什么两者在炎症调控方面却起着截然相反的作用?基于以上研究背景,我们将实验分为两个部分:1、验证7-KC和TO90对LPS诱导的RPE细胞炎症反应具有相反作用,并采用RNA-seq和蛋白质谱关联分析研究其可能的机制。2、探讨DEX在EIU小鼠模型中的作用及其机制。第一部分7-酮基胆固醇和TO901317在LPS诱导的视网膜色素上皮细胞炎症反应中的作用及其机制目的:肝脏x受体是调节脂质平衡和炎症反应的关键节点,外源性LXRs激动剂TO901317具有抑炎作用,而内源性的LXRs激动剂7-KC却起促炎作用。因此本实验旨在验证7-KC和TO90对LPS诱导的炎症调控具有相反作用,并运用转录组和蛋白组学关联分析探讨其潜在机制。方法:不同浓度7-KC刺激人视网膜色素上皮细胞系(ARPE-19)24和36小时。然后用CCK-8和Annexin-V FITC/PI双染色法检测ARPE-19细胞的活性和凋亡。EdU检测ARPE-19细胞的增殖。7-KC和TO90作用于ARPE-19细胞12小时后,再用5μg/mL的LPS刺激ARPE-19 细胞 24 小时。Real-time PCR 检测炎症因子 IL6、IL-8 和 LXRs及其靶基因ABCA1、ABCG1在mRNA水平的表达。Illumina Hiseq 2500平台和Q Exactive质谱仪用于转录组测序和蛋白质谱检测。结果:高浓度7-KC明显降低ARPE-19细胞活性并促进凋亡。不同浓度7-KC作用ARPE-19细胞24和36小时后增殖水平无明显变化。综合细胞活性、凋亡和增殖的结果,最终选择7.5μM的7-KC作为后续研究浓度。7-KC和TO90都能激活LXRs的靶基因ABCA1和ABCG1,但两者对LPS诱导的炎症反应却存在相反作用。7-KC以浓度依赖的方式上调IL-6、IL-8、LXRα、LXRβ和ABCA1、ABCG1的表达,而TO90却抑制炎症反应。转录组分析提示7-KC激活了 Toll-样受体和MAPK等信号通路,而TO90却抑制这些通路。转录组和蛋白质组联合分析发现7-KC不仅调控脂质代谢,还激活Toll-样受体、MAPK、mTOR、HIF-1和VEGF信号通路及炎症相关基因,而TO90却未直接调控这些炎症通路和基因。结论:LXRs的内源性和外源性激动剂7-KC和TO90都激活其靶基因ABCA1和ABCG1,但TO90起抑制炎症的作用,而7-KC却起促炎作用。这种矛盾效应可能与7-KC和TO90对Toll-样受体、HIF-1、VEGF、mTOR和MAPK等炎症信号通路和脂代谢相关基因的不同调控有关。第二部分DEX在内毒素诱导性葡萄膜炎(EIU)中的作用及其机制的研究目的:探讨地塞米松(DEX)对内毒素诱导性葡萄膜炎(EIU)的作用及采用转录组测序研究其潜在的机制。方法:在BALB/c小鼠玻璃体腔内注射125 ng内毒素(LPS)诱导EIU小鼠模型,每隔4小时用0.1%DEX滴眼,共6次。采用裂隙灯观察每个组小鼠眼前房炎症并进行临床评分,HE染色观察形态学改变。RNA测序(RNA-seq)进行转录组的研究。Real-time PCR检测炎症因子在mRNA水平的表达及验证选中的差异表达基因。结果:DEX滴眼后显著减轻了 EIU小鼠前房和后房的炎症并降低IL-6、TNF-α、MCP-1 和 ICAM-1 在 mRNA 水平的表达。RNA-seq 共检测出52个差异表达基因,与DEX+LPS组相比,在LPS组中上调的基因有37个,下调的基因有15个。差异表达基因的功能分析未发现显著富集的GO Terms,KEGG富集分析发现有6个显著上调和2个显著下调的通路。KEGG结果提示DEX治疗后可下调RIG-I类受体信号通路(Ddx58、Ifih1、Isg15)及一些免疫炎症相关基因(Ifit1、H2-T24、Mx2 和 Eif2ak2)。结论:DEX在LPS引起的EIU小鼠眼部炎症中起保护作用,此保护作用可能与下调RIG-I类受体信号通路及一些免疫炎症相关基因有关。
【图文】：

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逦Ｍｅｒｇｅ逡逑ＩＯＢ９ＩＢＨＢ邋ＢＫＢ逡逑图１．１邋ＡＲＰＥ－１９细胞的ＲＰＥ特异性抗体ＲＰＥ－６５的染色鉴定？（放大倍数ｘ４００）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＲＰＥ－１９邋ｃｅｌｌｓ邋ｗｉｔｈ邋ＲＰＥ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ＲＰＥ６５邋ａｎｔｉｂｏｄｙ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ．邋（Ｔｈｅ逡逑ｍａｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｘ４００）逡逑２．２不同浓度的７－ＫＣ对ＡＲＰＥ－１９细胞活性的影响逡逑为了探讨不同浓度７－ＫＣ对ＡＲＰＥ－１９细胞活性的影响，我们采用ＣＣＫ－８试剂逡逑盒检测不同浓度７－ＫＣ刺激ＡＲＰＥ－１９细胞２４和３６小时后细胞的活性。我们发现逡逑当７－ＫＣ浓度小于５邋ｊｉＭ的时候，刺激２４和３６小时后ＡＲＰＥ－１９细胞活性增强。另逡逑外，当７－ＫＣ刺激２４小时，大于１０邋ｐＭ的７－ＫＣ浓度可显著降低ＡＲＰＥ－１９细胞的逡逑活性；当７－ＫＣ刺激３６小时，大于７．５邋ｐＭ的７－ＫＣ浓度便可显著降低ＡＲＰＥ－１９细逡逑胞的活性（图１．２）。逡逑２４邋ｈｏｕｒｓ逦３６邋ｈｏｕｒｓ逡逑２００－１逦１５０－１逡逑＊＊＊＊＊＊逡逑ｍＳＬｍ邋＿ＺＣ＿邋＊逡逑ｔ１５０－邋ａ邋ｔ＾－ｎｎ邋ｎ逡逑Ｂｉ00－ｎｎｆ｜逦１逦｜逡逑＞逦Ｉ逦＞邋５０－逦Ｉｔ逡逑＝５０－逦Ｉ逦＝逦｜逡逑＜３逦■基＊＊＊＊＊＊邋ｇ逦＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊逡逑７－ＫＣ逦７－ＫＣ逡逑图１．２不同浓度７－ＫＣ刺漱ＡＲＰＥ－１９细胞２４和３６小时后细胞的活性（＊ｐ＜０．０５，，邋＊＊ｐ＜０．０１，逡逑＊＊＊ｐ＜０．００１

细胞活性,炎症因子,最佳作用,细胞

２．１不同浓度的ＴＯ９０对ＡＲＰＥ－１９细胞活性的影响逡逑我们选用（０，邋０．１，１，５，邋１０，邋１００）邋ｐＭ的ＴＯ９０刺激ＡＲＰＥ－１９细胞２４和３６小时。逡逑结果发现，ＴＯ９０对ＡＲＰＥ－１９细胞的活性无明显影响（图１．６）。根据以前的文献逡逑经验，我们选择印Ｍ的ＴＯ９０作为后续研究的浓度。逡逑２４邋ｈｏｕｒｓ逦３６邋ｈｏｕｒｓ逡逑ｇ，逦？逦＾逡逑ｌ＾ｎｎｉｌｉａｌ邋ｌ１＇°Ｔｉｎｎｉａｉａ逡逑ＩＩＩ邋１邋Ｉ邋ｓ邋ＩＩＩ逡逑0＿0邋丨丨邋ｉ邋丨丨邋１１邋１１１邋１１１逦0．0邋ＩＩ邋！邋Ｉ邋１邋１１１邋■邋１１！邋Ｉ逦ｏ．ｏ邋丨丨■丨丨邋ｉ邋丨邋Ｉ邋丨邋１１１１逡逑夕逦＜ｓ＾逦＜ｆ逡逑ＴＯ９０（ｎＭ）逦ＴＯ９０（ｎＭ）逦ＴＯ９０（ｎＭ）＋ＬＰＳ（５＾ｇ／ｍｌ）逡逑图１．６不同浓度的ＴＯ９０对ＡＲＰＥ－１９细胞活性的影响（１１＝５邋）？逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．６邋Ｃｅｌｌ邋ｖｉａｂｉｌｉｔｙ邋ｏｆ邋ＡＲＰＥ－１９邋ｃｅｌｌｓ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｗｉｔｈ邋ＴＯ９０邋ｆｏｒ邋２４邋ａｎｄ邋３６邋ｈｏｕｒｓ邋（ｎ＝５）．逡逑２．２ＴＯ９０作用时间的选择逡逑为了找到ＴＯ９０的最佳作用时间，我们分别提前３、６、１２小时加入ＴＯ９０预逡逑处理ＡＲＰＥ－１９细胞，然后加入５邋ｐｇ／ｍｌ的ＬＰＳ刺激２４小时。结果显示提前１２小逡逑时加ＴＯ９０可显著降低炎症因子ＩＬ－６和ＩＬ－８在ｍＲＮＡ水平的表达，而提前３、６逡逑小时加ＴＯ９０均不能抑制ＬＰＳ诱导的炎症反应（图１．７）。因此
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R774.1

【参考文献】