CNTF基因修饰的骨髓间充质干细胞对蓝光损伤视网膜的保护研究

发布时间：2020-06-02 04:03

【摘要】：背景:蓝光在日常生活中随处可见,适量蓝光对维持视功能和昼夜节律具有重要意义,而强蓝光照射可引起RPE细胞氧化应激,最终导致视网膜损伤。年龄相关性黄斑变性的病程与光损伤有相似之处,但激光和抗VEGF药物均不能达到理想的疗效,因此构建光损伤的动物模型对研究年龄相关性黄斑变性意义非凡。骨髓间充质干细胞可旁分泌神经营养因子保护视网膜,具有可塑性,且在宿主体内发挥免疫调节功能,因此在视网膜疾病的研究中被广泛应用。CNTF可促进RPE细胞存活,加速光感受器的更新,促进Müller细胞分泌神经营养因子等,从而保护视网膜。但CNTF蛋白在眼内作用时间短,需通过反复多次注射维持其对视网膜的作用,增加眼内炎和眼球结构破坏的风险。本研究通过构建CNTF修饰的骨髓间充质干细胞,探讨其对蓝光损伤视网膜的保护作用。目的:体外培养RPE细胞,饲养SD大鼠,通过蓝光照射在细胞和动物水平建立蓝光损伤模型,研究过表达CNTF的骨髓间充质干细胞对蓝光损伤的RPE细胞和SD大鼠视网膜的影响,进一步研究骨髓间充质干细胞经基因修饰后功能的变化,为治疗视网膜疾病提供新策略。方法:分离提取视网膜色素上皮细胞和骨髓间充质干细胞,分别培养至1代和3代,进行细胞鉴定。分别利用腺病毒和慢病毒转染骨髓间充质干细胞,使其过表达CNTF。细胞实验中,CNTF-BMSCs和GFP-BMSCs与蓝光损伤的RPE细胞进行共培养;动物实验中,在蓝光损伤的SD大鼠视网膜下腔分别移植CNTF-BMSCs和GFP-BMSCs,检测RPE细胞和视网膜中的氧化损伤指标MDA和抗氧化指标SOD,ELISA检测细胞和视网膜中VEGF的分泌水平,行视网膜血管铺片,在荧光显微镜下观察血管的渗漏情况。Baf A1预处理RPE细胞,行Western blot检测共培养后自噬流水平的变化。激光共聚焦显微镜下观察冰冻切片中CK18与GFP的共定位情况,观测干细胞的迁移和分化情况。通过TUNEL与LC3免疫荧光共定位检测,判断RPE细胞和视网膜中自噬与凋亡之间的关系。利用F-ERG检测,评估CNTF-BMSCs和GFP-BMSCs对蓝光损伤视网膜视功能的影响。结果:成功分离培养、鉴定SD大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)和RPE细胞。强蓝光照射引起RPE细胞和视网膜氧化损伤,CNTF-BMSCs通过体外共培养和体内视网膜下腔移植,下调MDA,同时上调SOD水平,抑制VEGF的分泌。移植到视网膜下腔的CNTF-BMSCs可表达CK18,使SD大鼠F-ERG检测中最大反应总振幅增加。结论:CNTF基因修饰可增强BMSCs对氧化应激的抵抗能力,减少视网膜VEGF的分泌量和视网膜血管渗漏,增强自噬抑制视网膜凋亡,并在移植后分化为受损的RPE细胞,通过细胞替代作用减轻蓝光对视网膜的损伤。
【图文】：

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【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R774

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