MiRNA-29b调控p53表达在正常人眼结膜下Tenons囊成纤维细胞中表达的研究

发布时间：2020-06-04 08:53

【摘要】：目的通过离体原代培养人眼Tenon’s囊成纤维细胞,模拟体外青光眼术后滤过道瘢痕形成的过程,检测正常的成纤维细胞和活化了的肌成纤维细胞中microRNA-29b和p53的表达水平调控关系,探讨青光眼滤过术后滤过道瘢痕形成的机制。方法取安徽医科大学第一附属医院眼科手术室2016年3月至2016年7月眼科斜视手术病人术眼正常Tenon’s囊组织,用组织块培养法培养出原代成纤维细胞,传代至2-4代并进行实验。用TGF-β1(10ng/ml)将成纤维细胞活化为肌成纤维细胞,分别用qPCR和IHC技术检测p53 mRNA和蛋白在成纤维细胞和肌成纤维细胞中在表达水平。用si RNA转染抑制成纤维细胞中p53的表达,使用qPCR检测miRNA-29b和p53在成纤维细胞、活化的肌成纤维细胞和转染后的肌成纤维细胞中的表达情况。再用SPSS16.0软件等软件进行数据分析。结果1.用组织块培养法约2周左右可见细胞从组织边缘爬出,6-8周可细胞可铺满细胞培养瓶瓶底,在放大10倍的倒置显微镜下可见成纤维细胞体积较大,呈典型的扁平长梭形,细胞核居中,呈规则卵圆形,细胞之间成螺旋状排列。将细胞传代后用TGF-β1(10ng/ml,48h)活化后,细胞由成纤维细胞活化为肌成纤维细胞,细胞体积增大且细胞形态不规则,边缘毛躁,细胞之间呈无序状态。2.分别将成纤维细胞和活化的肌成纤维细胞消化爬片后,按照免疫组化步骤操作,DAB染色后,倒置显微镜下观察发现细胞核着色深染,而细胞质未着色,说明p53蛋白表达于细胞核中,呈黄褐色弥漫性分布,细胞质中未见表达。根据着色深浅可以看出MFs中p53蛋白的表达量明显高于HTFs组。选用image proplus软件对免疫组化所有图片根据染色着色程度不同进行分析,独立样本均数t检验显示:各组数据均服从正态分布,两组细胞中p53蛋白表达量MFs组(0.0419±0.0124)高于HTFs(0.0089±0.0085)组,t=-10.384,P0.05,N=3,差异有统计学意义。3.将HTFs细胞及MFs细胞提取mRNA,逆转录为cDNA后,经过qPCR比较p53mRNA的相对表达量。采用独立样本t检验,分析HTFs及MFs细胞中p53的表达水平。结果显示,与HTFs(1±0.0672)比较,MFs中p53的表达量(4.8650±0.2577)明显增高,t=-19.821,p0.05,N=3,差异具有统计学意义。4.将HTFs细胞,MFs细胞及siRNA转染的细胞提取mRNA,逆转录cDNA,用qPCR验证p53mRNA相对表达量,观察p53是否转染成功,再用qPCR检测miRNA-29b的相对表达量。qPCR结果显示,三组细胞中miR-29b的表达量从高到低依次为:siRNA-p53转染组,HTFs正常组,MFs活化组,采用KruskalWallis H检验的统计学方法,对各组细胞中p53的表达量及miR-29b的表达量进行分析。发现各组中,p53:HTFs组1(1,1),MFs组3.9750(1.6350,6.2452),siRNA转染组0.0560(0.0112,0.1195),阴性对照组0.9750(0.8300,1.1200)。miR-29b:HTFs组1(1,1),MFs组0.5450(0.4500,0.6100),siRNA转染组5.0500(3.0875,4.1700),阴性对照组1.0250(0.9475,1.1250),用KruskalWallis H检验的统计学方法对各组p53mRNA数据进行分析,X2=15.928,双侧P值为0.000,认为各组之间有差别,再将各组进行两两比较,除阴性对照组与HTFs组P0.05,差异无统计学意义外,其余各组中p53的表达量均有差异,p0.05,差异均有统计学意义。同样,用Kruskal-Wallis H检验的统计学方法对各组miR-29b数据进行分析,X2=22,双侧P值为0.000,认为各组之间有差别,再将各组进行两两比较,除阴性对照组与HTFs组P0.05,差异无统计学意义外,其余各组中miR-29b的表达量均有差异,p0.05,差异均有统计学意义。5.通过划痕实验比较HTFs细胞及MFs细胞迁徙能力,发现HTFs活化为MFs后,细胞的迁徙能力增强。结论活化了的MFs中,p53mRNA及p53蛋白表达均增高,而miRNA-29b表达降低,下调p53表达后,MiRNA-29b表达上调,说明MiRNA-29b可能通过下调p53的表达而抑制青光眼术后滤过道瘢痕的形成。
【图文】：

3.结果3.1Tenon’s 囊组织原代培养出的 HTFs 形态特点用组织块培养法培养原代成纤维细胞，约 2周左右，可见组织块周围有散在小的长梭形细胞（图 1A），组织块边缘有长梭形细胞游离出，后细胞数量逐渐增多，在组织块周围呈放射状密集生长，各个组织块周围细胞生长迅速，约 3-4周细胞间逐渐相互接触连接，约 6-8 周左右（图 1B），，细胞可铺满整个培养瓶底部，在倒置显微镜下可见组织块周围成纤维细胞，呈典型的扁平长梭形，细胞核居中，呈规则卵圆形，沿着组织块放射状生长，细胞之间成螺旋状排列。

quickly.Cell growed around the tissue block radially. The ach other and arranged spirally.后的形态学观察合生长至培养瓶底部面积 80％左右时，选取生长状态化传代，被胰酶消化的细胞呈椭圆形或者短梭形悬浮箱中，放置约 6小时，取出倒置显微镜下观察，大部 HTFs 形态粗短，继续培养 24小时后可见细胞已完全一致，继续培养数日后可见细胞间再次融合，呈螺旋
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R779.6

【参考文献】

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本文编号：2696144