AMPK-mTOR通路在脂多糖诱导的人鼻粘膜上皮细胞自噬的分子机制研究

发布时间：2020-06-20 21:26

【摘要】：研究背景慢性鼻窦炎(Chronic rhinosinusitis,CRS),是耳鼻喉科的最常见的疾病之一,一般指持续超过12周的鼻腔与鼻窦粘膜的慢性炎症。多中心统计研究表明不同国家的CRS发病率均有逐年增加的趋势。CRS虽然不是致命性疾病,却导致病人很多功能、记忆及感情方面的损害。随着鼻用药物及功能性内镜鼻窦手术的发展,CRS的诊疗水平有了很大的进步,但是临床工作中仍发现很多复发的病人。这类病人即使经规范的药物治疗及多次鼻内镜翻修手术,治疗效果仍不尽如人意,这可能与CRS的复杂的病因学及发病机制尚不清除有关。目前认为致病的主要因素有:细菌、病毒感染;鼻腔解剖结构异常;上皮细胞功能障碍;变态反应及免疫功能下降等,其中细菌感染是CRS公认的重要致病因素之一。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)为革兰氏阴性杆菌细胞壁外膜的重要组成部分,能激活单核-巨噬细胞胞,炎症细胞大量浸润,释放白介素、肿瘤坏死因子等活性物质,引起炎症反应。鼻腔粘膜的上皮细胞是一道天然的屏障,具有活跃的分泌功能,在外界理化因素的刺激下,释放细胞因子作用于其他细胞,在鼻腔、鼻窦的慢性炎症、损伤修复及重塑过程中起着重要作用。细胞自噬(Autophagy)是真核生物细胞中维持细胞生存,缓解细胞内外压力的重要代谢过程。细胞在内外环境压力变化下,形成一种双层膜的吞噬泡(phagophore),包裹细胞内损坏的长周期蛋白、变性坏死的细胞器或入侵的病原体形成自噬体,然后在细胞骨架微管网络系统的作用下与溶酶体融合,在溶酶体酸性水解酶的作用下进一步消化降解,为细胞的再循环提供原料和能量。然而,在一定条件下,自噬溶酶体过量降解了正常的细胞器和长周期蛋白导致细胞主动性死亡,即细胞自噬死亡(Autophagic cell death)。细胞自噬是一个非常复杂的动态连续的过程,自噬在不同疾病甚至在同一疾病的不同阶段扮演着不同的角色。研究表明,有30多种分子组成不同的信号通路调控自噬,这些分子统称为Atg(Autophagy-related)家族。微管相关蛋白 1 轻链 3(Microtubule-associated protein lA/1B-1ightchain3,LC3)是自噬过程的关键蛋白,贯穿于自噬的全过程,是酵母Atg8的同源物。当自噬发生时,LC3先被Atg4裂解形成水溶性LC3-Ⅰ,然后在Atg7和Atg3的催化下,与脂酰乙醇胺结合脂化形成LC3-Ⅱ。脂溶性的LC3-Ⅱ成为自噬体的内外膜上的标记蛋白,其含量与自噬体的数量成正比。LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ已被公认为是Western blot检测自噬的金标准。近年来自噬在呼吸系统疾病(如呼吸道感染、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等)发病机制的研究中取得了长足的进步。Tanaka A等人发现吸烟导致气道上皮细胞产生活性氧分子,通过磷酸化JNK激活LC3-Ⅱ,使用抗氧化剂可抑制LC3-Ⅱ的表达。在哮喘的发病过程中,自噬可影响Thelper(Th)1、Th2的分化及平衡,介导哮喘相关病原体的免疫炎症反应。Dickinson JD等人研究认为IL-13能通过诱导自噬调节呼吸道杯状细胞的合成与分泌;Martin等人报道儿童哮喘与Atg5和Atg7的多态性相关,急性哮喘发作的患者中鼻腔粘膜上皮细胞Atg5的表达明显高于对照组。呼吸道的粘膜均来源于原肠胚内胚层,粘膜上皮细胞以假复层纤毛柱状上皮为主。鼻腔、鼻窦粘膜与呼吸道粘膜相互延续,很多疾病存在多方面的相互作用和影响,近年来学者提出“同一气道,同一疾病”的理论。因而,我们推测CRS的鼻粘膜上皮细胞的自噬水平是否发生变化,查找国内外文献仅有台湾课题组研究认为鼻息肉的自噬水平降低,与环氧合酶-2高表达有关,而CRS的鼻粘膜上皮细胞自噬水平未见报道。自噬在CRS发病机制中扮演的角色需要进一步研究和探讨。本课题第一部分先从mRNA、蛋白水平检测自噬标志蛋白LC3在CRS组织中的表达情况;分离培养CRS的原代人鼻粘膜上皮细胞,利用透射电镜及荧光显微镜观察自噬表达情况。第二部分用LPS刺激人正常鼻粘膜上皮细胞,检测不同浓度LPS对人鼻粘膜上皮细胞增殖及凋亡的影响;利用透射电镜及GFP-LC3融合蛋白荧光显微镜下观察自噬的标志结构;Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及自噬相关通路蛋白的表达水平,探讨AMPK-mTOR信号通路在LPS诱导的人鼻粘膜上皮细胞自噬中的作用及TLR4/MyD88信号通路与自噬的关系。第一部分慢性鼻窦炎中鼻腔粘膜上皮细胞自噬水平的初步研究研究目的:从mRNA、蛋白水平检测LC3-Ⅱ在CRS中的表达水平;分离培养CRS的原代鼻粘膜上皮细胞,利用透射电镜及免疫荧光显微镜分别观察自噬体及GFP-LC3融合蛋白表达情况。实验方法:1.术中收集18例慢性鼻窦炎(不伴有息肉)患者和10例对照组的钩突粘膜作为样本。2.利用免疫组织化学染色法分别检测LC3-Ⅱ在CRS组和对照组中的定位及表达水平的差异。3.TRIzol法从28例样本中提取总RNA,反向转录为cDNA,用qRT-PCR方法比较了两组样本中LC3表达差异。4.分离培养CRS及对照组的人鼻粘膜上皮原代细胞,透射电镜观察CRS组细胞内的自噬体并计数;通过转染带荧光标记GFP-LC3质粒,荧光显微镜下观察带有绿色荧光的自噬体的分布状态并统计分析。5.结果用SPSS18.0软件分析,用Fisher检验分析结果,P0.05时表示差异有统计学意义。实验结果:1.免疫组织化学染色结果显示,CRS组和对照组钩突粘膜组织中LC3-Ⅱ均表达在细胞质中,弱阳性及阳性时呈黄色、棕黄色;强阳性时呈棕褐色,细胞膜和间质也可染色。LC3-Ⅱ在88.9%(16/18)CRS钩突粘膜组织中高表达,而仅在30%(3/10)的对照组中高表达,差异显著(P = 0.003)。2.qRT-PCR结果显示LC3-Ⅱ mRNA在CRS组和对照组钩突粘膜组织中相对表达量均值分别为(3.188±0.3887)和(1.025±0.1543)。统计学分析显示,LC3-ⅡmRNA在CRS组中表达明显增加(P0.001)。3.透射电镜下,分离培养的CRS的鼻粘膜上皮原代细胞可观察到典型双层膜结构的自噬小体。4.将GFP-LC3质粒瞬时转染CRS鼻粘膜上皮原代细胞,荧光显微镜观察到CRS组绿色的荧光点主要表达在细胞质中,而对照组的鼻粘膜上皮原代细胞仅可见少量的荧光点,差异显著。结论:CRS的鼻腔粘膜上皮细胞自噬水平明显上调,提示自噬可能参与了 CRS的致病过程。第二部分脂多糖通过AMPK-mTOR信号通路调控人鼻粘膜上皮细胞自噬的分子机制研究研究目的:探讨AMPK-mTOR信号通路在LPS诱导的人鼻粘膜上皮细胞自噬中的作用及TLR4/MyD88信号通路与自噬的关系实验方法:1.建立LPS感染人正常鼻粘膜上皮细胞的模型,CCK-8检测不同浓度LPS对人鼻粘膜上皮细胞增殖的影响;流式细胞仪分析不同浓度LPS对人鼻粘膜上皮细胞凋亡的影响。2.不同浓度LPS(0、1、5、10μg/ml)处理人鼻粘膜上皮细胞12h;另外一组加入10μg/ml的LPS,培养不同时间(0、6、12、24h)后,分别收集细胞,提取总蛋白,Western blot检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值和SQSTM1(P62)蛋白表达水平,测定不同浓度和不同处理时间对自噬的影响。3.透射电镜观察LPS处理后的鼻粘膜上皮细胞内含有双层膜的自噬小体并计数。4.通过瞬时转染带荧光标记GFP-LC3质粒的方法,荧光显微镜下观察人鼻粘膜上皮细胞中的绿色荧光点的分布状态并计数。5.采用不同浓度(0、1、5、10μ/ml)LPS刺激人鼻粘膜上皮细胞,检测自噬相关蛋白 P-AKT(Ser473)、AKT、P-AMPK(Tyr1 72)、AMPK、P-mTOR(Ser2448)、mTOR的表达情况;进一步使用AMPK抑制剂Compound C和LPS共同培养人鼻粘膜上皮细胞,测定自噬通路相关蛋白的表达情况。6.利用CRS与正常粘膜组织分离培养的鼻腔粘膜的上皮原代细胞,Western blot检测 LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及 P62、P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR 蛋白表达水平,进一步验证信号通路。7.采用不同浓度(0、1、5、10μg/ml)LPS处理人鼻粘膜上皮细胞,检测TLR4、MyD88及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白的表达情况;使用TLR4抑制剂Polymyxin B和LPS共同刺激人鼻粘膜上皮细胞,检测LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及TLR4、MyD88蛋白的表达情况。实验结果:1.不同浓度LPS处理后,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值随着浓度增加而逐渐升高,差异最明显是10μg/ml刺激组(P0.01),P62的表达水平则逐渐降低;同一浓度处理人鼻粘膜上皮细胞后,随着刺激时间的延长,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐升高,在12h处达到峰值,差异显著(P0.01),24h时表达水平有所下降,但与对照组仍有差异(P0.05),P62蛋白的表达水平则相反。2.用10μg/mlLPS与人鼻粘膜上皮细胞共培养12h后,在透射电镜下可观察到融合的双层膜的自噬囊泡、自噬溶酶体及降解后的自噬空泡。3.将瞬时转染GFP-LC3质粒的人鼻粘膜上皮细胞在不同浓度(0、1、5、10μg/ml)LPS刺激12h后,荧光显微镜观察发现聚集的GFP-LC3主要分布在细胞质,随着刺激浓度的升高,带有荧光点自噬体的阳性细胞比例显著增加,这与免疫印迹结果一致。4.用LPS处理人鼻粘膜上皮细胞后,随着刺激浓度的增加,P-AMPK表达量逐渐增高,P-mTOR表达量逐渐降低,而p-AKT没有明显的变化;使用AMPK抑制剂Compound C后,P-AMPK、P-mTOR的表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值介于对照组与LPS处理组之间。5.利用CRS与正常粘膜组织分离培养的鼻腔粘膜的上皮原代细胞,Western blot结果显示CRS组的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明显升高,P62表达量降低;同时P-AMPK蛋白相对表达量增多,P-mTOR的相对表达量减少。6.随着LPS刺激浓度的增加,TLR4、MyD88蛋白相对表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值逐渐升高;进一步使用TLR4抑制剂Polymyxin B,TLR4、MyD88的表达量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均介于对照组与LPS组之间。结论:1.LPS能诱导人鼻粘膜上皮细胞产生自噬,并呈剂量-效应和时间-效应依赖关系。2.LPS通过AMPK-mTOR信号通路诱导人鼻粘膜上皮细胞产生自噬。3.TLR4/MyD88依赖的信号通路也参与了 LPS诱导的人鼻粘膜上皮细胞的噬。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R765.41
【图文】：

图２邋ｑＲＴ－ＰＣＲ结果逡逑

培养的,双层膜,上皮,上皮细胞

图３自噬小体在人鼻粘膜上皮原代细胞的表达情况逡逑图Ａ显示在ＣＲＳ培养的人鼻粘膜原代上皮细胞可见双层膜的自噬小体，而对未见明显自噬小体。逡逑Ｂ对照组与３例ＣＲＳ培养的鼻粘膜上皮细胞自噬小体的定量分析（＊＊邋Ｐ＜逡逑．０１＊＊＊邋Ｐ＜邋０．００１）。逡逑３

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