顺铂诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞自噬的作用和机制

发布时间：2020-07-12 20:45

【摘要】：目的探讨顺铂诱导的视网膜母细胞瘤Y79细胞自噬的作用及机制。方法Y79细胞按浓度为0、1、5、10、20μM加入Cis培养,CCK-8法检测细胞IC_(50)。将Y79细胞分为对照组(Control)、顺铂组(Cis)和顺铂联合应用自噬阻断剂3-甲基腺嘌呤组(Cis+3-MA),透射电镜观察自噬体;单丹磺酰尸胺(Dansylcadaverine,MDC)对细胞进行染色,流式细胞仪检测各组光密度(OD)值;各组细胞按0、5、10、25、50、100μM加入Cis培养,CCK-8法检测细胞抑制率;Annexin V/PI双染流式法检测各组细胞凋亡;q-PCR检测各组细胞[凋亡及存活相关(Bax,Bcl-2)以及耐药相关(MRP3、MRP7、P-gp)]基因的转录情况。Fluo-4 AM钙离子荧光探针检测Y79细胞加入顺铂前后细胞内钙离子水平变化;Western Blot检测CaMKK2、AMPK、mTORC1、LC3蛋白表达情况。结果顺铂处理细胞后,透射电镜观察到双层或多层膜的球状结构的自噬小体明显增多,应用自噬阻断剂3-MA后,自噬小体数量减少;MDC染色流式细胞仪测定OD_(355),Cis组OD值至明显高于Control组(P0.01),Cis+3-MA组OD值低于Cis组(P0.05);应用自噬阻断剂3-MA预处理细胞后,各浓度点顺铂抑制率均大于单独应用顺铂处理的细胞;顺铂处理细胞后,与Control组相比凋亡率增加(P0.05)应用3-MA下调自噬水平后,凋亡率进一步增加(P0.05);与Control组相比,Cis组抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调(P0.01),Bax表达上调(P0.01),各组细胞耐药相关基因MRP3、MRP7和P-glycoprotein转录水平降低(P0.01);加入自噬阻断剂3-MA后Bcl-2表达进一步下降(P0.01),Bax较Cis组上升(P0.05),耐药相关基因MRP3、MRP7和P-glycoprotein转录水平进一步降低(P0.05)。Fluo-4 AM钙离子探针染色激光共聚焦显微镜观察结果显示,顺铂处理肿瘤细胞后,细胞内荧光水平明显高于对照组;Western-blot结果显示,与Control组比较,Cis组钙调素依赖的蛋白激酶激酶2(CAMKK2)、p-AMPK、LC3II明显上调,mTORC1下调(P0.05)。结论1顺铂可以诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞产生自噬。2抑制自噬可以提高顺铂诱导视网膜母细胞瘤Y79细胞的凋亡率,并降低细胞耐药相关基因的表达,说明顺铂诱导的自噬对细胞起保护作用并参与了视网膜母细胞瘤Y79细胞的化疗耐药。3顺铂可能是通过提高细胞内钙离子浓度激活CAMKK2/AMPK/mTORC1通路诱导Y79细胞产生自噬的。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.7
【图文】：

图 1 透射电镜观察各组细胞产生自噬的情况Fig. 1 observation of autophagy by transmission electron microscope图 2，表 9：Western-blot 结果灰度值计算：Control 组 LC3 II /LC3 I 的值为0.30±0.05、Cis 组为 0.54±0.08、Cis+3-MA 组为 0.39±0.03，经 t 检验，Cis 组和Control 组差异有统计学意义（P＜0.05），Cis 组灰度值较高。CL3I/I0.20.40.60.8***（a） （b）

图 1 透射电镜观察各组细Fig. 1 observation of autophagy by tran图 2，表 9：Western-blot 结果灰度值计0.30±0.05、Cis 组为 0.54±0.08、Cis+3-MA Control 组差异有统计学意义（P＜0.05），Ci（a） （

注：*表示 Cis 与 Control 相比，差异有统计学意义。**表示 Cis+3MA 与 Cis 相比，差异有统计学意义。.4.3 顺铂诱导的自噬对 Y79 细胞凋亡的影响自噬对视网膜母细胞瘤细胞顺铂抑制率及凋亡的影响见图 4-5，表 11。图 4，表 11：应用自噬阻断剂 3-MA 预处理细胞后，各浓度点顺铂抑制率均单独应用顺铂处理的细胞。凋亡结果显示，control 组凋亡率为（10.19±0.49)%is 组凋亡率为（21.20±0.90）%，Cis+3-MA 组凋亡率上升为(26.49±0.31）%，经验，P＜0.05，差异有统计学意义，Cis 组与 Control 组相比凋亡率升高，加入A 后，凋亡率继续上升。

【参考文献】

相关期刊论文 前9条

1 路璐;唐松;郭慧;刘桂琴;赵东升;;全身化学药物治疗对晚期视网膜母细胞瘤患儿肿瘤浸润和眼外转移及特定疾病生存率的影响[J];中华眼底病杂志;2016年04期

2 夏杰军;张靖;;视网膜母细胞瘤经眼动脉灌注化学药物治疗研究进展[J];中华眼底病杂志;2016年03期

3 任明玉;李静;王立芳;刘立民;高占国;;视网膜母细胞瘤临床分期与治疗分析[J];中国实用眼科杂志;2016年04期

4 熊延路;王明星;韩勇;李小飞;卢强;高明;赵晋波;;AMPK:细胞能量中枢[J];现代生物医学进展;2014年31期

5 白海霞;项晓琳;李彬;;玻璃体腔注药治疗视网膜母细胞瘤的研究进展[J];国际眼科纵览;2014年05期

6 张雨;陆红玲;徐刚;;PI3K/AKT通路在非小细胞肺癌顺铂耐药中的作用[J];中国肺癌杂志;2014年08期

7 刘瑾;朱豫;;视网膜母细胞瘤的治疗进展[J];眼科新进展;2013年01期

8 陈洪菊;屈艺;母得志;;mTOR信号通路的生物学功能[J];生命的化学;2010年04期

9 张发仁;许丽艳;沈忠英;李恩民;;自噬的概述[J];汕头大学医学院学报;2005年04期

本文编号：2752471