VEGI在糖尿病视网膜病变患者中的表达及对视网膜血管新生作用的研究

发布时间：2020-07-23 04:13

【摘要】：目的糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病最常见的眼部并发症,其中增生性糖尿病视网膜病变(PDR)已成为致盲的主要眼疾之一。血管新生是NPDR进展到PDR的关键过程,这一过程,是血管生长因子和血管抑制因子之间的平衡失调导致的。因此,寻找理想的抑制新生血管生成的药物,并调节促进血管生长因子和抑制血管生长因子之间的平衡,已成为预防和治疗DR的关键。VEGI是一种新的血管新生拮抗剂,能够抑制内皮细胞增生、血管形成和肿瘤生长。研究表明,VEGI可以促进mFlt1退化并上调sFlt1表达,从而抑制VEGF,对血管新生起负性调节。本研究将探讨VEGI对视网膜血管内皮细胞的作用,从而为DR的治疗提供新的方向。本课题首先探讨VEGI在PDR、NPDR患者与非DM患者玻璃体中的表达差异;然后以牛视网膜血管内皮细胞为研究对象,在高糖状态下过表达VEGI,检测细胞增殖、迁移、成管及细胞因子的改变;构建小鼠视网膜新生血管病变模型,视网膜下腔注射VEGI慢病毒表达载体,应用OCT、IVIS等方法探讨其对视网膜血管渗漏、血管新生的抑制作用。本研究将为VEGI改善DR病变提供理论基础。方法本课题分四部分进行。第一部分增生性糖尿病视网膜病变患者与非增生性糖尿病视网膜病变患者玻璃体中VEGI的表达差异从天津医科大学第二医院眼科和天津眼科医院玻璃体视网膜手术患者术中留取标本,需手术治疗的非DM患者16例、NPDR患者19例、PDR患者12例。于手术过程中留取患者玻璃体组织,置于干冰中。受试者在实验前签署了知情同意书,证明对本研究的目的理解,并知道必需的研究流程,愿意加入本研究。同时收取患者的血糖、血脂、肝肾功能等临床指标。应用Western blot检测技术检测二组间VEGF、VEGI等因子的表达。第二部分VEGI在小鼠糖尿病视网膜病变模型中的表达变化由于我们无法获得人视网膜标本,因此无法检测糖尿病患者视网膜组织中VEGF和VEGI的表达变化。因此,我们以STZ诱导的糖尿病小鼠作为1型DM小鼠模型,以高脂喂养的KK-Ay小鼠作为2型DM小鼠模型,采用OCT检测小鼠活体视网膜病变情况,并通过HE染色、WB等方法检测VEGI和VEGF的表达情况,以及VEGFR1和VEGFR2的表达情况。第三部分VEGI对视网膜血管内皮细胞增殖、迁移、成管变化以及相应细胞因子的影响在细胞水平,高糖状态下过表达VEGI后,检测细胞增殖、迁移、成管变化以及相应细胞因子的改变。分离培养人视网膜微血管内皮细胞,给予不同浓度葡萄糖刺激(25mM,30mM,50mM),转染pcDNA3.1+/VEGI/GFP质粒和pcDNA3.1/GFP质粒后,应用CCK8、migration、mitragel等试验分别检测细胞增殖、迁移及成管变化。第四部分VEGI对高氧诱导的小鼠视网膜新生血管作用的研究构建小鼠视网膜新生血管病变模型,新生C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、VEGI干预组;模型组、VEGI干预组均置于高氧环境下饲养,最后通过HE染色和荧光素血管灌注及视网膜铺片观察视网膜血管变化。结果1.在我们随机选取的临床标本中,DM组患者和对照组大多数临床指标无统计学差异。DM组糖化血红蛋白(HbA1c)明显高于对照组(P0.01)。T2DM+NPDR组与T2DM+PDR组相比,T2DM+PDR组患者的HbA1c水平较高(P0.05)2.与非糖尿病组相比,DM组患者玻璃体中VEGI的蛋白表达水平明显减少;T2DM+NPDR组与T2DM+PDR组相比,T2DM+PDR组患者玻璃体中VEGI的水平进一步减少。而与非糖尿病组和T2DM+NPDR组相比,T2DM+PDR组患者玻璃体中VEGF的蛋白表达水平明显增加;T2DM+NPDR组与非糖尿病组相比,VEGF的蛋白表达水平也明显增加。3.与非糖尿病组相比,DM组患者玻璃体中VEGI/VEGF的比值明显减低;T2DM+NPDR组与T2DM+PDR组相比,T2DM+PDR组患者玻璃体中VEGI/VEGF的比值减低更加明显。4.与对照组小鼠相比,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠的血糖水平均明显升高(P0.05)。KK-Ay小鼠血脂水平升高、空腹的胰岛素水平(INS)、胰岛素抵抗指数HOMA-IR和胰岛素分泌基础指数HOMA-β均明显升高(P0.05)。而STZ造模鼠血脂无明显变化。5.OCT成像结果显示,在DM发病6个月,与正常组C57小鼠相比,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠视网膜厚度明显减少。6.HE染色结果显示,无论是STZ造模的1型DM小鼠还是KK-Ay代表的2型DM小鼠,在DM发病6个月,与正常组C57小鼠比较,其内层视网膜层厚度均明显降低。7.同正常对照组C57小鼠比较,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠视网膜组织中VEGI蛋白表达水平均显示显著减低(P0.05),但STZ造模鼠和KK-Ay小鼠之间无统计学差异;同正常对照组C57小鼠比较,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠视网膜组织中VEGF蛋白表达水平均显示明显升高(P0.05),但STZ造模鼠和KK-Ay小鼠之间无统计学差异;同正常对照组C57小鼠比较,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠视网膜组织中pAKT/tAKT比值明显升高(P0.05)。8.在30mM和50mM的高糖状态下,牛视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和成管均明显增加,而转染VEGI后牛视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和成管均明显受到抑制。9.HE染色显示,正常组小鼠,视网膜内界膜光滑平整,未出现异常结构,各层视网膜结构清楚,视网膜各层厚度正常,极少有内皮细胞突破内界膜。而模型组小鼠,视网膜各层厚度明显减少,并有大量内皮细胞突破内界膜,向玻璃体腔生长,排列异常紊乱,并有新生血管形成。VEGI干预组小鼠视网膜突破内界膜的内皮细胞核数较模型组少,内界膜完整性也较好。10.荧光素血管灌注及视网膜铺片结果显示,正常小鼠可见视盘血管从视盘部放射状发出,均匀分布、自然走行,未观察到明显无灌注区和渗漏出的造影剂;模型组:观察到大片无灌注区出现在视乳头的周边,视网膜的大血管不规则扩张,迂曲走行,在无灌注区的周围出现新生血管丛,并伴有明显的荧光渗漏;VEGI干预组:在视乳头的周边没有明显的无灌注区和新生血管丛,荧光渗漏减轻。结论1.与NDM和NPDR患者相比,PDR患者玻璃体中VEGI水平降低而VEGF水平增加,且VEGI/VEGF的比值明显减低。2.与NPDR患者相比,PDR患者玻璃体中VEGI水平降低而VEGF水平增加,且VEGI/VEGF的比值明显减低。3.同正常对照组C57小鼠比较,STZ造模鼠和KK-Ay小鼠视网膜组织中内层视网膜厚度均明显降低,VEGI蛋白表达水平均显示显著减低,VEGF蛋白表达水平均显示明显升高,pAKT/tAKT比值明显升高,VEGFR1蛋白表达水平均显示显著减低,而VEGFR2蛋白表达水平均显示显著升高。4.高糖可以促进牛视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移和成管,以及增加牛视网膜血管内皮细胞VEGF的表达,50mM的葡萄糖效果更明显;VEGI转染后可以明显抑制内皮细胞的增殖、迁移和成管。5.高氧诱导的模型组小鼠有大量内皮细胞向玻璃体腔突出,排列紊乱,并伴有新生血管形成;VEGI干预组的小鼠视网膜中向内界膜突破的内皮细胞数目较模型组少,内界膜的完整性也较好。6.高氧诱导的模型组小鼠视乳头的周边出现较大的无灌注区,在无灌注区的周围出现新生血管丛,并伴有明显的荧光渗漏;VEGI干预组的小鼠视乳头的周边没有明显的无灌注区和新生血管丛,荧光渗漏减轻。
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R774.1
【图文】：

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的表达可能为临床提供了新的治疗思路，起到抑制视网膜血管新生，防治糖尿病视网膜病变的作用（图 1）。为了解 VEGI 与 DR 间的相关性，本研究通过非糖尿病患者、糖尿病患者中无视网膜病变、非增生性糖尿病视网膜病变、增生性糖尿病视网膜病变患者玻璃体中 VEGI、VEGF、VEGFR 的表达差异，探讨其在动物水平能否改善糖尿病大鼠视网膜病变模型中视网膜血管渗漏、血管新生等情况，明确 VEGI 能否在细胞水平抑制视网膜血管内皮细胞增殖、迁移和成管，为临床治疗 DR 提供新的理论依据，从而为糖尿病视网膜病变的药物治疗提供新的方向。

玻璃体,表达水平

图 2 western blot 检测玻璃体中 VEGI 与 VEGF 的表达水平NDM T2DM+NPDR T2DM+PDR0.00.51.01.5elatRievxpreessonifoEVIG**#图 3 三组玻璃体中 VEGI 表达水平的统计学分析注：与 NDM 组相比，*P<0.05；与 T2DM_NPDR 组相比，#P<0.0

糖尿病视网膜病变,动脉瘤,眼底,视网膜

网膜内出血：在视网膜上出现更多的，较大的红色不规则病变，并不会影响视力，治疗及时一般 3 到 4 个月内可以恢复（图 6B）；（3）硬性渗出：黄色不规则形状的病变，代表视网膜脂类和蛋白质沉积，伴有视网膜增厚者为糖尿病性黄斑水肿的典型表现（图 6C）；（4）棉絮斑：浅羽缘白色病变，代表毛细血管闭塞造成的神经纤维层梗塞（图 6D）；（5）视网膜微血管异常：毛细血管闭合导致血管重塑的改变；（6）串珠状静脉：扩张、迂曲，不规则口径静脉，邻近毛细血管无灌注；（7）黄斑水肿：血-视网膜屏障破裂促使血浆从血管渗漏入视网膜导致视网膜肿胀，可以出现在 DR 的早期，常伴随有硬性渗出和微血管瘤（图6C）；（8）新生血管：新血管异常增殖，可延伸至玻璃体腔引起玻璃体出血（图6E）；（9）玻璃体出血：玻璃体腔内出血（图 6E）；（10）牵引性视网膜脱离：纤维增生伴新生血管的收缩可以将视网膜脱离其解剖位置；（11）新生血管性青光眼：新血管生长进入眼睛的排水系统并引起堵塞，升高眼压。

【参考文献】