miR-22对视网膜母细胞瘤Y79细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响及其机制的研究

发布时间：2020-07-26 07:18

【摘要】：目的视网膜母细胞瘤是最常见的儿童眼内肿瘤,其治疗效果差、致死率高,严重威胁患儿的视力甚至生命。肿瘤的发生和发展是一个涉及细胞的增殖、凋亡、侵袭和迁移等的复杂的生物学过程,并由很多的信号通路参与。因此,抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移以及促进细胞的凋亡对于控制肿瘤的发展具有重要的意义。MicroRNA是一类广泛存在的,长约19-25个核苷酸大小的内源性非编码单链RNA,通过特异性抑制或者降解靶mRNA的翻译从而调节靶基因的表达。通过靶基因参与细胞一系列生命活动的调控,如细胞周期、细胞分化、细胞增殖和凋亡等功能。研究表明miR-22在多种肿瘤中异常表达,通过调节细胞的增殖或凋亡,直接影响肿瘤的发生和发展。有研究发现miR-22在视网膜母细胞瘤中低表达,但其具体生物学功能及机制尚不清楚。在本论文中,我们研究了miR-22对Y79细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响,并阐述其可能的作用机制,为视网膜母细胞瘤的治疗提供新的思路和理论依据。方法1.转染miR-22过表达真核质粒上调miR-22的表达,将细胞分为正常组(N)、阴性对照组(GV251)、过表达miR-22组(GV251/miR-22)。CCK-8法检测各组细胞的增殖,细胞划痕实验观察各组细胞的迁移率,Transwell实验观察各组细胞侵袭的细胞数,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。2.利用RT-qPCR和Western blot检测以上各组细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。3.转染miR-22shRNA真核质粒,RT-qPCR检测细胞miR-22的表达。将细胞分为正常组(N)、阴性对照组(GV249)、低表达miR-22组(GV249/miR-22-siRNA),利用RT-qPCR和Western blot检测以上各组细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。4.转染HMGB1shRNA真核质粒,利用RT-qPCR和Western blot检测细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。将细胞分为正常组(N)、阴性对照组(GV102)、低表达HMGB1组(GV102/HMGB1-siRNA)。CCK-8法检测各组细胞的增殖,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移,Transwell实验观察各组细胞侵袭的细胞数,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。5.转染过表达HMGB1真核质粒,利用RT-qPCR和Western blot检测细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。共转染miR-22和HMGB1,将细胞分为N,GV251/miR-22,GV251/miR-22+GV230,GV251/miR-22+GV230/HMGB1四组,CCK-8法检测各组细胞的增殖,细胞划痕实验检测各组细胞的迁移,Transwell实验观察各组细胞侵袭的细胞数,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。6.Y79细胞分为N,GV251/miR-22,GV102/HMGB1-siRNA,GV230/HMGB1,GV251/miR-22+GV230/HMGB1五组,Western blot观察各组细胞AKT和p-AKT的表达。结果1.转染过表达miR-22真核质粒明显上调miR-22的表达(P0.05)。与阴性对照组相比,过表达miR-22组细胞的增殖减低,迁移率降低,细胞侵袭的细胞数减少,细胞的凋亡率增加。提示上调miR-22抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞的凋亡。2.与对照组相比,过表达miR-22组细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平明显降低。3.转染miR-22shRNA真核质粒明显降低miR-22的表达(P0.05)。与对照组相比,低表达miR-22组细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平明显增加。4.转染HMGB1shRNA真核质粒,明显降低细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。与阴性对照组相比,低表达HMGB1组细胞的增殖减低,迁移率降低,细胞侵袭的细胞数减少,细胞的凋亡率增加。提示敲低HMGB1的表达抑制细胞的增殖、迁移和侵袭,促进细胞的凋亡。5.转染过表达HMGB1真核质粒,明显提高细胞HMGB1的mRNA和蛋白表达水平。与GV251/miR-22+GV230组相比,共转染miR-22和HMGB1组细胞的增殖和迁移力增强、侵袭的细胞数增多、细胞的凋亡率减低。提示共转染miR-22和HMGB1逆转了过表达miR-22对细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。6.Western blot结果显示GV251/miR-22和GV102/HMGB1-siRNA组AKT的磷酸化水平较正常组明显减低,差异有统计学意义(P0.05)。GV230/HMGB1组AKT的磷酸化水平较正常组明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。共转染组AKT磷酸化水平较GV251/miR-22组明显增加,差异有统计学意义(P0.05)。结论上调miR-22显著抑制细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞的凋亡。miR-22在Y79细胞中负向调节HMGB1的表达,miR-22通过HMGB1发挥抑制细胞的增殖、迁移和侵袭并促进细胞的凋亡的作用。PI3K/AKT通路参与miR-22/HMGB1对Y79细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.7
【图文】：

基因测序,重组质粒,鉴定结果,表达水平

B图 1-1 GV251/miR-22 重组质粒 PCR 及基因测序鉴定结果。(A) GV251/miR-22 重组质粒PCR 结果。(B) GV251/miR-22 重组质粒基因测序结果。Fig1-1 PCR and gene sequencing results of miR-22 overexpression recombinant plasmid. (A)PCR result of GV251/miR-22 recombinant plasmid．(B)Gene sequencing result of GV251/miR-22recombinant plasmid．2.2 转染 GV251/miR-22 对 miR-22 表达水平的影响为了研究 miR-22 在视网膜母细胞瘤中具体的生物学功能，我们在上海吉凯基因公司构建成功 miR-22 过表达重组质粒 GV251/miR-22，转染 Y79 细胞上调miR-22 的表达水平。实验分为 GV251/miR-22，GV251，N 三组，U6 作为内参，用 RT-qPCR 检测各组细胞 miR-22 的表达水平。如图 1-2 所示，GV251/miR-22

过表达,表达水平,重组质粒,荧光定量PCR

iR-22 重组质粒基因测序结果。quencing results of miR-22 overexpression re-22 recombinant plasmid．(B)Gene sequencing -22 对 miR-22 表达水平的影响在视网膜母细胞瘤中具体的生物学功能iR-22 过表达重组质粒 GV251/miR-22，实验分为 GV251/miR-22，GV251，N 三细胞 miR-22 的表达水平。如图 1-2 所调 miR-22 水平（约 1 倍），差异有统

转染,细胞增殖,实验观察,统计学意义

quantitative PCR detected the effect of miR-22 oveession level of miR-22. U6 is set as an internal 1 group.细胞增殖的影响CK-8 实验观察上调 miR-22 对细胞增殖的251,N 三组，转染 GV251/miR-22 后 0h，6殖的影响。6h GV251/miR-22 组较 GV2512h，24h，48h GV251/miR-22 组较 GV251 组统计学意义(P<0.05)。也就是说，上调 miR2 组较 GV251 组显著抑制细胞的增殖。

【参考文献】