骨髓间充质干细胞联合组织工程材料在声带成形术中的应用研究

发布时间：2020-07-26 19:47

【摘要】：目的探讨骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BM-MSC)移植联合组织工程材料透明质酸(Hyaluronic acid,HA)对瘢痕性声带固有层的组织再生的作用。方法获取培养鉴定得到大鼠的BM-MSC后运用绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein,GFP)标记大鼠的BM-MSC。在体外实验中,通过流式细胞仪检测GFP标记的BM-MSC细胞的增殖和表达来评估大鼠BM-MSC嵌入透明质酸(Hyaluronic acid,HA)的兼容性和稳定性。体内实验中,将16只大鼠随机分为4组,根据右侧声带损伤1月后注射治疗采用不同的注射物命名为生理盐水组(S组)、BM-MSC(M组)、HA(E组)、BM-MSC植入HA(M+E组)。所有的大鼠右侧声带损伤1个月后,分别注射生理盐水(S组)、BM-MSC(M组)、HA(E组)、BM-MSC植入HA(M+E组),通过注射方法治疗瘢痕形成的声带。在治疗后的1个月,检测Ⅲ型前胶原肽(procollagen-III)、纤连蛋白(Fibronectin,FN)、透明质酸合酶-III(Hyaluronic acid synthase 3,HAS3)、透明质酸酶(Hyaluronidase 3,HYAL-3)、平滑肌肌动蛋白(Smoothelin,SMA)以及转化生子因子-β1(Transforming growth factor-β1,TGF-β1)的m RNA的表达水平,做免疫组化评价治疗效果;GFP标记的存活的BM-MSC的通过免疫荧光来评估;将各组大鼠喉标本切片使用苏木素和伊红(Hematoxylin and Eosin,HE)染色后于10倍镜下分析大鼠声带固有层厚度,以正常大鼠的固有层作为对照,固有层厚度的取值:最厚部位厚度、最薄部位厚度以及中间部位厚度这3个数值的中值。结果BM-MSC植入HA在体外生长表达Sca-1、透明质酸受体CD44阳性,并能继续增殖。在体内研究中,GFP标记的BM-MSC注射治疗瘢痕声带1月后仍能检测到存活的BM-MSC。植入在HA的BM-MSC组III型前胶原、纤连蛋白,TGF-β1水平升高。植入在HA的BM-MSC,相比单独注射BM-MSC组,SMA表达下调,而HYAL3表达上调;同生理盐水组比较,HAS3相比没有变化,大鼠的SMA表达下调,而HYAL3表达上调。BM-MSC组、BM-MSC联合HA治疗组和HA治疗组的固有层厚度明显小于对照组,和正常组接近。结论将BM-MSC和HA联合注射到大鼠受损的声带中,可促进声带固有层细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的沉积和生长因子的产生,而不影响成肌纤维细胞的分化,促进瘢痕声带的修复。
【学位授予单位】：福建医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R767.91
【图文】：

脂滴,细胞,周细胞,阴性

酶标仪数据分析软件（KC 4 from BioTek）用于荧光分析，整个操作程序避免光和热的干扰。1.3 结果1.3.1 绿色荧光蛋白标记结果腺病毒转染后 12 h 可见有绿色荧光蛋白 GFP 表达, 1-3 d 内表达荧光细胞逐渐增多、强度增强，即绿色荧光蛋白标记成功。1.3.2 成骨、成脂诱导分化结果成骨诱导 1 周后 BM-MSC 形态发生明显变化，早期碱性磷酸酶染色显示蓝紫色片状沉积，碱性磷酸酶表达较高，诱导 3 周时茜素红染色可见多处钙沉积形成的矿化结节，茜素红染色可见明显的钙结节形成；成脂诱导第 2 周，可见多量圆形细胞，从第 2-3 周，圆形细胞内部有脂滴形成（图 1.1）并逐渐增多。

负吸收,染料,细胞的,法统

CD-44 阳性表达率达 92%，BM-MSC 表面标志物 Sca-1 表达率达 60%。不表达造血系的细胞表面标志物 CD11b、CD19 和 CD45。此外，BM-MSC 植入HA 培养在无细胞毒性的荧光标记物 3 天通过 Alamar Blue 法统计呈正增值。即大鼠 BM-MSC 植入 HA 在体外培养时体表标志物表达阳性，并保持活力和有丝分裂增值的活性。

基因表达水平,统计学意义,生理盐水

异有统计学意义 (p<0.01)。BM-MSC 注射组的 TGF-β1 mRNA 的表达水平也比生理盐水组高，差异具有统计学意义 (p<0.01)；但结果显示，HA 注射组的TGF-β1 mRNA 的表达水平比生理盐水组低很多，两组之间差异有统计学意义（(p<0.01)。由上述结果可以得出：BM-MSC 和 HA 联合治疗提高影响成肌纤维细胞的分化，但可促进 TGF-β1 的释放；在促进 TGF-β1mRNA 的表达上，联合注射 BM-MSC 和 HA 也具有协同作用。比较采用定量实时 PCR 法分析所得的生理盐水注射组（S 组)、MSC 注射组（M 组）、HA 注射组（E 组）、BM-MSC 联合 HA 注射组（M+E 组）的声带固有层各基因的 mRNA 的表达情况。相比其他组，BM-MSC 联合 HA 注射组的细胞外基质基因表达谱显示具有最佳治疗效果。

【参考文献】