miR-203a在中耳胆脂瘤中的表达与作用机制的研究

发布时间：2020-08-11 12:59

【摘要】：目的:中耳胆脂瘤是由角化鳞状上皮在颞骨内异常生长而形成的一种界限清楚的囊性病变,由它引起的胆脂瘤型中耳炎是耳鼻咽喉科的常见疾病。像肿瘤一样胆脂瘤上皮细胞具有高度的增殖活性,尽管目前研究胆脂瘤病理机制的方向很多,争议也很多,然而没有一种学说理论能够完整的解释胆脂瘤的所有临床特征,但胆脂瘤上皮细胞具有高度的增殖活性被认为是该病的基本特征。miRNAs参与了包括增殖、分化、凋亡和迁移等一系列重要的生命进程,具有广泛而重要的生物功能。特别是很多miRNAs对肿瘤的生长、迁移和侵袭具有抑制作用,发挥着抑癌功能,更是成为研究的热点。miR-203a具有上皮组织特异性,是影响上皮细胞生长、分化以及功能的重要分子,并在上皮源性肿瘤中发挥着防癌、抑癌的作用。同时,miR-203a是调控角质形成细胞增殖和定向分化的关键因子,它的出现抑制了细胞的干性,使细胞停止增殖,开始定向分化。通过生物信息学软件分析,我们发现人类Bmi1基因是miR-203a的预测靶基因。Bmi1归属于是Polycomb家族,是具有遗传修饰作用的转录抑制因子,主要通过改变染色体的结构来沉默相关基因的表达。它在人体多数组织和大量恶性肿瘤中均有表达,在维持正常细胞和肿瘤细胞的干性和自我更新方面起着至关重要的作用。胆脂瘤因为也具有包括异常的增殖、迁移和侵袭等很多类似肿瘤的特性,所以我们推测发挥抑癌作用的miRNAs在胆脂瘤中的表达可能会有变化。目前,国内外关于miRNAs在胆脂瘤中的报道比较少见,而对于起到调节角质形成细胞增殖分化作用的miR-203a及其预测靶基因——维持细胞干性的Bmi1在胆脂瘤中的报道更是没有出现过。我们通过检测miR-34a、miR-125a和mi R-203a三种常见的起抑癌作用miRNAs在胆脂瘤和耳后正常皮肤中的表达情况,筛查出mi R203a在胆脂瘤中的表达明显低于耳后正常皮肤,紧接着分析miR-203a在胆脂瘤中的表达量与胆脂瘤的临床类型等特征是否具有相关性。我们预测了miR203a的靶基因Bmi1,并通过检测Bmi1在胆脂瘤及其对应的耳后正常皮肤中的表达和分布情况,分析这种表达是否存在差异,同时分析Bmi1在胆脂瘤中表达与miR-203a的表达是否有相关性。最终通过双荧光素酶活性检测分析和在人角质形成细胞中的调控实验来验证它们的靶向关系是否成立。为了模拟胆脂瘤中miR-203a的表达下调,我们在人角质形成细胞转染miR-203a抑制剂,检测细胞的生物学行为是否朝着胆脂瘤的方向发展。目前已经有很多研究发现在肿瘤中Bmi1能够通过提高Akt的磷酸化水平,进而调节PI3K/Akt信号通路,参与肿瘤的发生发展过程。同时,也有相关研究证实Akt的磷酸化水平升高也存在于胆脂瘤当中。因此我们检测胆脂瘤中p-Akt蛋白的表达情况以及与Bmi1的表达是否相关,最后在角质形成细胞中验证miR-203a能否通过调节Bmi1来影响p-Akt的表达进而调节PI3K/Akt信号通路的活性。目前国内外尚无报道miR-203a和Bmi1在胆脂瘤中表达情况以及调节机制的研究,希望本研究能为日后更深入的探索胆脂瘤发病机制的提供一定的帮助,为该病的预防和诊治提供一个新的方向。研究方法:研究对象和实验材料:共计56例胆脂瘤标本和28例耳后皮肤标本,其中有20对胆脂瘤标本和耳后皮肤标本取材自同一患者,为自身对照。患者入院后收集包括性别、年龄、病程、临床分型、是否首发、有无并发症等临床信息。所有患者均经临床和病理检查证实为后天性中耳胆脂瘤的患者。实验所用细胞为人永生角质形成细胞(HaCaT细胞),在含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基,37℃,5%CO2的条件下培养。实验方法:1、采用实时荧光定量PCR检测miR-203a、miR-34a和mi R125a在胆脂瘤组织和耳后正常皮肤组织中的表达情况。2、运用实时荧光定量PCR和western blot分别检测miR-203a和Bmi1在胆脂瘤组织中和与其对应的耳后正常皮肤组织中的表达情况。3、免疫组织化学染色观察Bmi1在胆脂瘤和耳后正常皮肤组织中的表达和分布情况。4、人永生角质形成细胞(HaCaT细胞)培养。5、采用瞬时转染将NC miR-mimics、miR-203a mimics、NC mi R-inhibitor和miR-203a inhibitor分别转染到HaCaT细胞中,应用real-time PCR和western blot检测Bmi1在各组细胞中mRNA和蛋白的表达水平。6、双荧光素酶基因报告检测分析miR-203a和Bmi1的靶向关系。7、采用瞬时转染将NC mi R-inhibitor、miR-203a inhibitor、Bmi1 siRNA、NC siRNA以及miR-203a inhibitor+Bmi1 siRNA转染到各组人角质形成细胞中,western blot检测转染效率,并培养24-48小时为后续实验准备。8、采用细胞集落克隆实验检测各组人角质形成细胞的集落形成能力。9、细胞增殖MTS实验检测各组人角质形成细胞的增殖情况。10、使用流式细胞仪对各组人角质形成细胞周期进程的变化进行检测。11、使用流式细胞仪对各组人角质形成细胞进行凋亡发生率的检测。12、人角质形成细胞迁移能力的检测使用Transwell细胞迁移实验。13、使用Western blot检测胆脂瘤和耳后皮肤组织中p-Akt蛋白的表达情况。14、应用免疫组化染色检测p-Akt在胆脂瘤和皮肤组织中的表达和分布情况。15、Western blot检测不同转染组的人角质形成细胞中Bmi1、Total-Akt和p-Akt的表达情况。结果:1、real-time PCR检测结果显示miR-203a在胆脂瘤中的表达显著低于耳后正常皮肤组织,差异有统计学意义(P0.05)。miR-34a和miR125a在胆脂瘤和耳后正常皮肤中的表达无显著差异。2、miR-203a在胆脂瘤中的表达量与患者的性别、年龄、病史长短、是否首发、有无并发症以及胆脂瘤的分型等临床特征均无明显相关性(P0.05)。3、在20例有自身对照的胆脂瘤患者中,miR-203a在胆脂瘤中的表达均显著低于其对应的耳后正常皮肤组织,相反Bmi1蛋白在胆脂瘤中的表达则明显高于其对应的皮肤组织,person相关分析结果显示二者之间存在显著的负相关(P0.05)。4、免疫组织化学显示Bmi1主要为细胞核染色,在胆脂瘤上皮中几乎为全层染色且染色程度较强,在对应的耳后正常皮肤组织中主要表现为基底层细胞的染色。胆脂瘤和耳后皮肤两组之间阳性染色率的比较具有统计学差异(P0.05)。5、在人角质形成细胞中,上调miR-203a的表达时Bmi1的m RNA和蛋白的表达量均显著减少,而当下调miR-203a的表达时Bmi1的mRNA和蛋白含量则显著增加(P0.05)。6、经过预测和验证Bmi1是miR203a下游的靶基因。7、为了模拟胆脂瘤中miR-203a的低表达,我们在人角质形成细胞中转染miR-203a抑制剂,发现可以显著提高Bmi1的表达,而当共转染mi R-203a inhibitor和Bmi1 siRNA时,细胞中Bmi1的表达则几乎下降到对照组细胞的水平。8、细胞增殖MTS实验结果显示,当抑制角质形成细胞中miR-203a的表达时,细胞的增殖能力显著增强;而当共转染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA后,细胞的增殖能力则几乎下降到对照组水平。9、细胞集落克隆实验结果显示,当抑制角质形成细胞中miR-203a表达时,细胞集落形成明显;当共转染miR-203a inhibitor和Bmi1 si RNA后,细胞的集落形成能力则几乎恢复到对照组水平。10、细胞周期结果显示,当抑制角质形成细胞中miR-203a表达时,S期细胞所占的百分比增加,而G1期细胞所占的百分比减少;当共转染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA时,S期和Gl期细胞所占的百分比则几乎恢复到对照组细胞水平。11、细胞凋亡检测结果显示,抑制角质形成细胞中miR-203a的表达可以显著降低早期凋亡细胞所占比例;当共转染miR-203a inhibitor和Bmi1 si RNA时,凋亡细胞的数量则几乎恢复到对照组细胞水平。12、细胞迁移实验结果显示,抑制角质形成细胞中miR-203a的表达能够有效促进角质形成细胞的迁移;而当共转染miR-203a inhibitor和Bmi1 siRNA时,细胞迁移的能力则几乎恢复到对照组细胞水平。13、Western blot结果显示,p-Akt在胆脂瘤上皮中的表达要高于其对应的耳后正常皮肤组织,两者之间的差异有统计学意义(P0.05),并且在胆脂瘤中,p-Akt的表达与Bmi1的表达呈显著正相关(P0.05)。14、免疫组化结果显示p-Akt在胆脂瘤中主要表现为细胞浆染色,从基底层到基底上层几乎全层均有染色;p-Akt在耳后正常皮肤组织中多为基底层细胞的胞浆染色。胆脂瘤和耳后皮肤两组之间染色阳性率的比较有统计学差异(P0.05)。15、在胆脂瘤组织中Bmi1和p-Akt蛋白免疫组化阳性染色之间呈显著的正相关性(P0.05)。16、western blot检测结果显示,在转染了Bmi1 siRNA的人角质形成细胞中,Bmi1和p-Akt的表达均明显下降(P0.05),当共转染Bmi1 siRNA和mi R-203a inhibitor时Bmi1和p-Akt的表达得到了恢复。结论:1、通过对miR-203a、miR-34a和miR125a三种miRNAs的检测发现与耳后正常皮肤组织相比miR-203a在胆脂瘤组织中的表达明显下降。2、胆脂瘤中miR-203a的表达量与患者自身的各项临床特征无明显相关性。3、Bmi1蛋白在胆脂瘤中的表达升高,并与miR-203a的表达呈负相关。4、Bmi1是miR-203a下游的一个靶基因,并且受miR-203a的负向调控。5、胆脂瘤中miR-203a表达的下降减弱了对Bmi1的抑制作用,引起了胆脂瘤上皮细胞的过度增殖。6、抑制miR-203a通过上调Bmi1的表达促进人角质形成细胞的增殖、克隆和迁移能力,并抑制细胞凋亡。7、相比于正常皮肤组织p-Akt在胆脂瘤中呈现高表达,且与Bmi1的表达呈正向关。8、在人角质形成细胞中miR-203a通过靶向控制Bmi1来影响p-Akt的表达。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R764.21
【图文】：

柱状图,胆脂瘤,正常皮肤,蛋白

19图2 miR-203a和Bmi1蛋白在20对有自身对照的胆脂瘤及其对应的耳后正常皮肤中的表达情况及相关性的分析A：real-time PCR检测miR-203a在20对胆脂瘤组织及其对应的耳后正常皮肤组织中的表达情况的柱状图（每对标本3个复孔检测结果比较，* P <0.05）。B：western blot 检测 Bmi1 蛋白在 20 对胆脂瘤组织及其对应的耳后正常皮肤组织中的表达情况（C：胆脂瘤，S：对应的耳后皮肤）。C：20 对胆脂瘤及其对应的耳后正常皮肤中 miR-203a 表达量的分析比较结果，* P <0.05。D：20 对胆脂瘤及其对应的耳后正常皮肤中 Bmi1 蛋白表达量的分析比较结果，* P <0.05。E：miR-203a 与 Bmi1 在 20 例胆脂瘤组织中表达情况的 Pearson 相关性分析结果。

胆脂瘤,正常皮肤,免疫组化染色

图3 Bmi1在胆脂瘤和耳后正常皮肤组织中的免疫组化染色结果（×400）A：胆脂瘤组织中 Bmi1 的表达情况。B：耳后正常皮肤组织中 Bmi1 的表达情况。表 2 Bmi1 蛋白在 20 对胆脂瘤和耳后正常皮肤中染色阳性率的比较指标胆脂瘤（阳性率）耳后皮肤（阳性率） χ2P 值Bmi1 80%（16/20） 35%（7/20） 8.286 0.0043.4 miR-203a 靶基因 Bmi1 的预测和鉴定结果我们通过使用 TargetScan、miRanda 等生物信息学预测软件分析发现 Bmi1 的3’UTR 区域存在一个与 miR-203a 的结合位点（图 4A），并且此位点在不同物种间非常保守，在人、黑猩猩、恒河猴、松鼠、兔、猪、牛、猫等多种物种间的互补序列均一致。为了验证 Bmi1 的表达受 miR-203a 的调控，我们在人角质形成细胞（HaCaT 细胞）中分别转染 NC miR-mimics、miR-203a mimics、NC miR-inhibitor

角质形成细胞,共转,转染,干扰效率

37图 1 抑制 miR-203a 对人角质形成细胞中 Bmi1 蛋白的表达以及细胞生物学行为的影响A：western blot检测转染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共转miR-203a inhibitor+Bmi1siRNA时，Bmi1蛋白的表达情况。B：western blot检测转染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共转miR-203a inhibitor+Bmi1siRNA时，Bmi1蛋白的相对表达水平，* P<0.05。C：western blot检测人角质形成细胞中转染Bmi1 siRNA的干扰效率。D：细胞增殖MTS法检测转染NC miR-inhibitor、miR-203a inhibitor以及共转染

【参考文献】