负载异鼠李素的纳米粒子在鼻咽癌中抗癌功效及分子机制的研究

发布时间：2020-08-12 07:49

【摘要】：研究背景和目的开发一种以介孔硅纳米粒子(mesoporous silicananoparticles,MSNS)为载体,采用聚多巴胺(polydopamine,PDA)进行载体表面改良,使之具有pH敏感性的新型药物载体系统。通过MSNs-ISO@PDA和MSNs-ISO控制异鼠李素(Isorhamnetin,ISO)释放效率的差异,探讨PDA对粒子表面改良的影响,MSNs-ISO@PDA在鼻咽癌中抗肿瘤功效以及相关分子机制。方法和材料1.材料正硅酸乙酯(TEOS),十六烷基三甲基溴化胺(CTAB)盐酸多巴胺和盐酸去郁敏购买自Sigma-Aldrich公司(St.Louis,MO,USA)。氟化铵从阿拉丁实业有限公司购买。乙腈和甲醇均购自EMScience(HPLC级,MallinckrodtBaker,美国)。在这项工作中使用的主要抗体包括LC3抗体(兔源)是从Cell Signaling Technology公司购买(Beverly,MA,USA)。P62抗体是从Abmart公司购买(上海,中国)。Beclin 1 购自 Cell Signaling Technology 公司(Beverly,MA,USA).AKT,P-AKT、mTOR、p-mTOR、p-p70S6K、p70S6K 抗体购自 Santa Cruz(Santa Cruz,CA,USA)。人鼻咽癌 CNE-2 细胞从 American Type Culture Collection(ATCC)购买。用于整个研究的水从超纯MilliQ水净化系统获得(电阻18 MU cm)。2.方法2.1通过滴入正硅酸乙酯(TEOS)到十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和氟化铵(NH4F)的混合溶液中进行合成MSNs。装载ISO和阿霉素(DOX)并采用PDA进行粒子表面改良。MSNs-DOX@PDA和空白对照(MSNs@PDA)以同样的方法制备。采用一系列仪器和方法对纳米颗粒进行鉴定,同时分析和测定MSNs-ISO@PDA的药物载量。2.2 对 CNE-2 细胞分别用 FITC-MSNs-ISO 和 FITC-MSNs-ISO@ PDA 处理。采用共聚焦显微镜分析比较细胞对FITC-MSNs-ISO和FITC-MSNs-ISO @ PDA的吸收效率;噻唑蓝法(MTT)及细胞流式细胞仪检测细胞坏死及凋亡;RT-PCR、Western blot 和免疫荧光(Immunofluorescence IF)检测 MSNs@PDA、游离 ISO和MSNs-ISO@PDA在CNE-2细胞中对细胞自噬的影响。2.3 皮下接种CNE-2细胞建立人鼻咽癌裸鼠移植瘤模型,随机分为4组:生理盐水组(Control)、MSNs@PDA 组、ISO 组、MSNs-ISO@PDA,评估治疗后对种植瘤生长抑制作用;并通过体重监测评估体内MSNs-ISO@PDA的系统毒性。结果1.MSNs、MSNs-ISO 和 MSNs-ISO@PDA 颗粒的直径分别是 146.54±4.55、152.45±3.74 和 168.53±4.66nm。MSNs,MSNs-ISO 和 MSNs-ISO@PDA 的 zeta电位分别是-20.11±4.25,-10.57±3.42 和-32.56±3.37 mV。MSNs 的 BET 比表面积为246.46m2/g,孔体积为0.57 cm3/g,由BJH评价法测定最可能的孔径约为2.74 nm。随着负载ISO后,颗粒的BET比表面积和最可能孔径分别减小到132.35 m2/g 和 2.36nm。MSNs-ISO@PDA 的 BET 比表面积为 43.68m2/g。然而,由于表面的PDA涂层,MSNs和ISO-MSNs孔体积分别变成0.15和0.11 cm3/g。MSNs对ISO的负载效率约为96.63±3.42。2.在CNE-2细胞中,细胞对FITC-MSNs-ISO @ PDA的摄取效率明显高于FITC-MSNs-ISO;流式细胞分析技术也证实了细胞对FITC-MSNs-ISO@PDA的摄取效果更强MSNs-ISO@PDA比游离ISO和MSNs@PDA对CNE-2细胞的生长抑制更为明显;MSNs-ISO@PDA通过抑制AKT-mTOR-p70S6K信号通路诱导细胞自噬,促进细胞死亡。3.MSNs-ISO@PDA组显示出对种植瘤的生长抑制作用最强,在实验组中肿瘤生长较生理盐水对照组明显减慢;通过体重监测评估体内MSNs-ISO@PDA的系统毒性,MSNs-ISO@PDA组和其他组之间的体重差异没有统计学意义(P0.05,数据未显示)。结论本实验研究成功地设计了一种pH敏感的,以介孔二氧化硅纳米粒子为介导材料,并覆盖PDA涂层的药物传递系统。此外,MSNs-ISO@PDA通过诱导鼻咽癌细胞自噬作用而促进细胞死亡,从而具有良好的抗癌疗效。实验结果表明,相比之下负载ISO的MSNs-ISO@PDA药物载体系统具有明显的优势,包括良好的pH敏感性,更适宜于鼻咽癌细胞的摄取和治疗时低副作用等方面特点。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R739.63
【图文】：

介孔二氧化硅,纳米粒子,示意图,评价法

逦第一章合成和鉴别纳米颗粒、体外药物释放实验逦逡逑Ｔａｂｌｅｌ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ邋ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ邋ｏｆ邋ＭＳＮｓ，邋ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋ａｎｄ邋ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ逡逑Ｓａｍｐｌｅ逦Ｓｉｚｅａ逦ＺＰ逦ＢＥＴ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋Ｐｏｒｅ邋ｖｏｌｕｍｅ１５邋Ｐｏｒｅ邋ｓｉｚｅｃ逡逑（ｎｍ）逦（ｍＶ）邋ａｒｅａ邋（ｍ２／ｇ）逦（ｃｍ３／ｇ）逦（ｎｍ）逡逑ＭＳＮｓ逦１４６．５４土４．５５逦－２０．１１邋士４．２５逦２４６．４６逦ｑ邋５７逦２邋７４逡逑佭－ＩＳ0逦１５２．４５±３．７４逦－，０．５７±３．４２逦，３２．３５逦２Ｊ６逡逑ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ逦１６８．５３士４．６６逦－３２．５６士３．３７逦４３．６８逡逑０．１３逦－逡逑（ａ）用动态光散射法测量粒径。逦一邋一逡逑（ｂ）逦ＢＪＨ评价法测定孔体积为１．７和３００纳米的宽度之间的孔隙。逡逑（ｃ）最可能的孔径。逡逑（ａ）逦ＮＰｓ邋ｓｉｚｅ邋ｗａｓ邋ｍｅａｓｕｒｅｄ邋ｂｙ邋ｄｙｎａｍｉｃ邋ｌｉｇｈｔ邋ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ．Ｄａｔａ邋ａｒｅ邋ｍｅａｎ邋士ＳＤ逡逑（ｂ）逦ＢＪＨ邋ｃｕｍｕｌａｔｉｖｅ邋ｐｏｒｅ邋ｖｏｌｕｍｅ邋ｆｏｒ邋ｐｏｒｅｓ邋ｂｅｔｗｅｅｎ邋１．７邋ａｎｄ邋３００邋ｎｍ邋ｉｎ邋ｗｉｄｔｈ．逡逑（ｃ）逦Ｍｏｓｔ邋ｐｒｏｂａｂｌｅ邋ｐｏｒｅ邋ｓｉｚｅ．逡逑Ａ逡逑

释放速率,释放曲线,涂层

１．３．２体外实验表明药物释放对ＰＨ敏感逡逑为了验证ＰＤＡ涂层的药物封闭效果和ｐＨ敏感性，我们在不同的特定时间逡逑间隔下分别对ｐＨ值为５和ｐＨ为７．４两种条件检测药物释放情况。如图２Ａ所示，逡逑没有ＰＤＡ涂层时，ＤＯＸ在所有测试的ｐＨ值条件下迅速释放，即从ＭＳＮｓ的孔逡逑中通过自由扩散进入溶液。然而，在ｐＨ值７．４下，不同于ＭＳＮｓ邋－ＤＯＸ快速释逡逑放的是，ＭＳＮｓ－邋ＤＯＸ邋＠邋ＰＤＡ具有ＤＯＸ持续释放速率，这表明ＰＤＡ涂层有效逡逑保护ＤＯＸ从ＭＳＮｓ泄漏的作用（参见图２Ｂ）。有趣的是，ＭＳＮｓ－ＤＯＸ＠ＰＤＡ逡逑在ｐＨ值为５时比ｐＨ值为７．４时ＤＯＸ的释放速率有明显的加快（参见图２Ｂ），逡逑Ａ逦Ｂ逡逑８０逡逑－？－５．０逦－＊－５．０逡逑１00－邋－？－７．４逦７0邋—＊－７．４逦ｒ逡逑ｒ／逦ｒｆｒ＋＾＾＾逡逑！：／逦ｉｆ逡逑０邋0逦５逦１0逦１５逦２０逦２５逦0邋２０逦４０逦６０逦８０逦１００逦１２０逦１４０逦１６０逡逑Ｔｉｍｏ（ｈ）逦Ｔｉｍｏ（ｈ｝逡逑图２邋（Ａ）无ＰＤＡ涂层时ＤＯＸ释放曲线（ＰＨ值＝５时与ＰＨ值＝７．４时释放速率差异不逡逑大）。（Ｂ）有ＰＤＡ涂层时ＤＯＸ释放曲线（ＰＨ值＝５时比ＰＨ值＝７．４时释放速率明显加快）。逡逑３３逡逑

染色试验,细胞,共聚焦显微镜,效率

ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋和邋ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ邋的吸收效率。结果表明，在邋ＣＮＥ－２逡逑细胞中，细胞对ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ的摄取效率明显高于ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ。逡逑（图３邋Ａ）流式细胞分析技术也证实了细胞对ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ的摄取效逡逑果更强（图３Ｂ），可见细胞摄取ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ＠ＰＤＡ荧光强度数值明显更高逡逑（Ｐ＜０．０１）。这种增加可能是由于ＰＤＡ修饰的原因。逡逑Ａ逦Ｂ逡逑ＤＡＰＩ逦ＦＩＴＣ逦Ｍｅｒｇｅ逦■ＦＩＴｃ＊ｍｓｎ．＊？ｓｏ逡逑■逦ＲＴＣ＜ＭＳＮ？＜ＩＳ0ＳＰＤＡ逡逑枿懰｜邋３００0Ｊ逦Ｉ逡逑ＭｙｊＬ．；；ｊＰＨＮ１ＳＮ－，Ｓ（＞ａＰ，）Ａ逦＝邋２000－逦｜ＨＨ逡逑ＵＫｓａｍＢＭ逡逑图３邋细胞对ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ的摄取效率明显高于ＦＩＴＣ－ＭＳＮｓ－ＩＳＯ逡逑图Ａ共聚焦显微镜下显示ＤＡＰＩ和Ｆ１ＴＣ染色试验可见细胞对ＭＳＮｓ－ＩＳＯ邋＠邋ＰＤＡ摄取逡逑效率更高。逡逑图Ｂ为流式细胞分析技术

【参考文献】