自噬可减轻高糖条件下晶状体上皮细胞中的氧化损伤

发布时间：2020-08-26 20:14

【摘要】：背景糖尿病性白内障仍然是糖尿病患者视力残疾和失明的主要原因。已经有研究指出自由基水平的增加是糖尿病性白内障形成的最关键因素,而新近地报道称自噬也涉及糖尿病性白内障的形成,但两者在糖尿病性白内障形成过程中的相互关系并不完全清楚。目的检测自噬相关因子(LC3B,P62)和抗氧化因子过氧化氢酶CAT和超氧化物歧化酶SOD2(Mn SOD)在糖尿病小鼠晶状体上皮细胞(lens epithelial cells,LECs)中的表达情况,并且通过自噬增强剂和自噬抑制剂处理体外培养小鼠晶状体上皮细胞,以探讨自噬对高糖条件下自噬晶状体上皮细胞氧化应激的作用。方法取同批次的6-8周雄性C57BL/6小鼠80只,50只采用连续小剂量腹腔注射链脲佐菌素(STZ)(50mg/Kg/d)诱导Ⅰ型糖尿病小鼠模型作为实验组,剩余30只腹腔注射适当剂量体积的柠檬酸盐缓冲液作为对照组。3个月后检测实验组小鼠空腹血糖。使用透射电子显微镜观察实验组小鼠和对照组小鼠的晶状体上皮细胞自噬小体的形态变化;免疫组织化学法检测两组小鼠晶状体前囊膜组织中LC3B、P62蛋白和CAT和SOD2的表达和定位;荧光定量PCR法检测两组小鼠晶状体前囊膜LC3B,P62,CAT和SOD2等m RNA的表达量;western blot检测比较两组晶状体前囊膜中自噬与抗氧化相关蛋白LC3B,P62,CAT和SOD2的相对表达量。另取6-8周雄性C57BL/6小鼠的晶状体前囊膜做体外原代培养,分为4组:正常糖组(NG,5m M)、高糖组(HG,30m M)和高糖加自噬增强剂组(HG+RAPA)。通过蛋白质印迹检测各组自噬相关蛋白LC3B和P62以及氧化应激相关蛋白CAT和SOD2的水平变化。荧光探针Mito SOX Red检测三组线粒体氧化应激水平。结果透射电子显微镜发现,和对照组小鼠相比,实验组小鼠晶状体上皮细胞中的自噬体体积更大,且当中包含多个线粒体;免疫组织化学法显示,同对照组小鼠相比,实验组小鼠晶状体前囊膜中LC3B和P62蛋白表达均增强,但是SOD2蛋白的表达均降低;荧光定量PCR显示,实验组小鼠晶状体前囊膜中LC3B和P62 m RNA的相对表达量均高于对照组小鼠(1.10±0.05 vs.2.62±0.15;1.01±0.01 vs.1.89±0.20),但是SOD2 m RNA的相对表达量均低于对照小鼠(1.00±0.00 vs.0.53±0.08),差异均有统计学意义(t=14.25,P0.05;t=6.14,P0.05;t=8.00,P0.05);western blot检测显示实验组LC3B,P62蛋白的相对表达量均高于对照组(1.00±0.00 vs.1.24±0.09;1.00±0.00vs.3.19±1.04),差异有统计学意义(t=6.10,P0.05;t=3.65,P0.05),而SOD2蛋白的表达量要低于对照组(1.00±0.00 vs.0.63±0.05),差异有统计学意义(t=11.88,P0.05)。体外培养小鼠的晶状体上皮细胞中,通过WB我们发现高糖条件下LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值增加,P62蛋白含量增加,而SOD2和CAT蛋白水平下降(均P0.05);使用雷帕霉素处理细胞后,LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值进一步增加,P62水平降低,SOD2和CAT蛋白水平升高(均P0.05);荧光探针Mito SOX Red结果显示,相对于正常糖组,高糖组线粒体ROS水平较高,雷帕霉素组相对于高糖组线粒体ROS水降低。结论糖尿病小鼠晶状体上皮细胞中自噬现象和抗氧化蛋白出现异常,自噬功能失调和氧化损伤可能均在糖尿病性白内障的形成过程中发挥重要作用;一定程度的自噬上调可以减轻高糖诱导的晶状体上皮细胞的氧化应激水平从而抑制其损伤,深入研究二者相互作用机制,对糖尿病性白内障防治的具有重要的临床和社会意义。
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R587.2;R776.1
【图文】：

小鼠,晶状体上皮细胞,实验组,透射电子显微镜

青岛大学硕士学位论文第二章实验结果2.1 透射电子显微镜观察晶状体上皮细胞自噬小体的形态变化将小鼠晶状体树脂固定后进行切片，在瞳孔边相对应的晶体前囊膜处位置进行定位，即 A 区和 B 区(图 1A 左)；图右为晶状体前囊膜下附着的一层晶状体上皮细胞（图 1A 右）；透射电子显微镜显示，在对照组小鼠和实验组小鼠晶状体上皮细胞中均能发现双层膜包被的圆形或椭圆形的自噬小体，其内包裹着线粒体。但与对照组小鼠相比，实验组小鼠晶状体上皮细胞中的自噬小体体积更大，且包含多个线粒体。（图 1B）

小鼠,晶状体上皮细胞,蛋白,实验组

中均能发现双层膜包被的圆形或椭圆形的自噬小体，其内包裹着线粒组小鼠相比，实验组小鼠晶状体上皮细胞中的自噬小体体积更大，且体。（图 1B）A 图 1 透射电子显微镜显示对照组小鼠和实验组小鼠晶状体上皮细胞自噬小体形晶状体半薄片 B 实验组小鼠晶状体上皮细胞中的自噬小体体积更大，且包含多2.2 LC3B、P62 和 SOD2、CAT 蛋白在两组小鼠晶状体上皮免疫组织化学染色检测结果表明，LC3B 和 P62 蛋白在对照组和的晶状体上皮细胞中均有表达，但是在实验组小鼠晶状体上皮细胞中SOD2 和 CAT 蛋白在实验组小鼠中的表达降低（图 2）

实验组,糖尿病,统计学意义,灰度值

实验结果在实验组小鼠中的表达降低。2.3 荧光定量 PCR 法检测 LC3B、P62 和 SOD2、CATmRNA 的表达荧光定量 PCR 检测结果表明，对照组小鼠与实验组小鼠晶状体前囊膜中 LC3BmRNA 相对表达量分别为 1.10±0.05 和 2.62±0.15 差异有统计学意义（t=14.25，p<0.05）P62 mRNA 表达的灰度值分别为 1.01±0.01 和 1.89±0.20 差异有统计学意义(t=6.14，p<0.05) MnSOD mRNA 表达灰度值分别为 1.00±0.00 和 0.53±0.08，差异均有统计学意义（t=8.00,P<0.05）；CAT mRNA 表达灰度值分别为 1.00±0.00 和 0.75±0.08，差异均有统计学意义（t=5.54,P<0.05）(图 3)。

【参考文献】