B细胞上的CD23表达通过Bregs分泌IL-10调节T细胞的活化

发布时间：2020-09-03 10:33

　　背景和目的变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)又称过敏性鼻炎(hypersensitive rhinitis),是鼻科常见病之一,是由抗原提呈细胞引起的过敏原摄取,由IgE介导的,T细胞向Th2的极化所引起的I型变态反应性疾病,并与变应性哮喘具有密切联系。近年来,AR在大多数国家和地区发病率显著上升,据统计全球平均发病率为10%~40%,我国平均发病率为11%,,疾病负担日益加重,已成为全球性的健康问题。IgE具有2种不同的受体,即高亲和力受体FcεRI和低亲和力受体CD23(FcεRII)。CD23可在B细胞、单核细胞、T细胞、树突状细胞、血小板等细胞表面表达,主要有细胞膜表面和可溶状态两种存在形式。越来越多的证据表明,CD23在通过IgE促进的抗原呈递在控制变应原特异性T细胞的活化中起重要作用,最新研究发现B细胞上的CD23的表面密度决定了通过IgE促进的变应原呈递,进而导致过敏原特异性T细胞的激活。调节性B细胞(Breg cells,Bregs)是能够产生IL-10并发挥负向免疫调节作用的B细胞群。近年来发现了Bregs的其它免疫学功能,包括抗原提呈、分泌多种细胞因子等。在实验性免疫性脑脊髓膜炎、胶原诱导的关节炎、慢性结肠炎以及多发性硬化等疾病的动物模型中都已证实Bregs具有负向免疫调节作用。在变应性疾病中,Bregs可以通过分泌IL-10、转化生长因子β(TGF-β)等细胞因子的方式促进调节性T细胞(Treg cells,Tregs)的分化或是直接抑制免疫性T细胞的增殖。T型辅助性细胞分为1型(Th1)和2型(Th2),是适应性免疫系统的主要反应,其分泌的细胞因子、效应细胞、免疫蛋白不同。在Th1为主反应的期间,T型辅助细胞主要分泌IL-2、IFN-γ;在Th2为主反应的期间,T型辅助细胞主要分泌IL-4、IL-5和IL-13;肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞为主要的效应细胞;并能产生IgE。而变应性鼻炎即为Th2反应为主的变态反应。本研究旨在阐明B细胞上的CD23的表达,与调节性B细胞分泌IL-10水平以及后续T细胞的活化在变应性鼻炎发生发展中的作用。实验方法第一阶段动物试验阶段,取48只SPF级雌性的SD大鼠,采用随机的原则分为空白对照组(A组)、变应性鼻炎组(B组)、鼻腔滴入组(C1组),皮下注射组(C2组),每组12只。第1、5、14、21天,正常对照组采用氢氧化铝佐剂腹腔注射作为阴性对照,变应性鼻炎组、抗体干预组(C1和C2)用氢氧化铝联合卵清蛋白腹腔注射进行基础及强化致敏后,第22-35天,空白对照组用生理盐水滴鼻作为阴性对照,变应性鼻炎组、抗体干预组均采用10%的卵清蛋白生理盐水溶液滴鼻,1次/天;抗体干预组在卵清蛋白生理盐水溶液滴鼻激发前30分钟,鼻腔滴入组给予抗CD23抗体滴鼻处理,1次/天;皮下注射组给予抗CD23抗体大鼠右腿股部皮下注射处理,1次/天。末次激发完成后,观察记录各组大鼠在规定时间内(30min)的鼻部症状,记录完成后对空白对照组给予生理盐水加1%的伊文思蓝(Evens蓝)混合液0.1ml背部皮内注射作为阴性对照,变应性鼻炎组、抗体干预组,给予含有1mg卵清蛋白加1%的伊文思蓝(Evens蓝)混合液0.1ml皮内注射,记录局部皮肤硬结及染料扩散情况,水合氯醛麻醉后进行腹主动脉取血,最后用颈椎脱臼法处死大鼠。HE染色观察鼻黏膜组织学变化及嗜酸性粒细胞浸润情况,免疫荧光检测CD23、CD19、IL-10在四组大鼠鼻腔黏膜中的表达量。酶联免疫吸附试验ELISA检测四组小鼠血清中总IgE、OVA-IgE、IL-10、IL-4、IFN-γ。流式加BD QuantiBRITE PE珠检测血液中CD19~+CD23~+、CD19~+CD5~+CD1d~+B细胞百分率及B细胞表面CD23的表面密度及CD3~+CD4~+T细胞百分率。第二阶段临床试验阶段,搜集我院鼻科住院患者40例,其中单纯鼻中隔偏曲患者20例作为对照组(甲组),过敏性鼻炎患者20例作为实验组(乙组),均依据2015年变应性鼻炎诊断和治疗指南(2015年,天津)确诊或排除诊断,取其鼻中隔粘膜及静脉血。HE染色观察鼻粘膜组织学变化及嗜酸性粒细胞浸润情况,免疫荧光检测CD23、CD19、IL-10在两组鼻粘膜中的表达量。酶联免疫吸附试验ELISA检测两组血清中总IgE、IL-10、IL-4、IFN-γ水平。流式联合BD QuantiBRITE PE珠检测血液中B细胞膜表面CD19~+CD23~+、CD19~+CD5~+CD1d~+B细胞百分率及B细胞上CD23的表面密度及CD3~+CD4~+T细胞百分率。结果与空白对照组大鼠(A组)相比,变应性鼻炎组(B组)的喷嚏、挠鼻次数明显增加;皮下硬结明显,染料扩散;鼻粘膜HE染色出现大量的嗜酸性粒细胞浸润,动静脉扩张、基底膜破坏明显;免疫荧光发现CD23表达增强,CD19、IL-10表达减弱;酶联免疫吸附试验ELISA检测显示总IgE、OVA-IgE、IL-4增高,IL-10、IFN-γ降低;CD19~+CD5~+CD1d~+B细胞百分率降低,CD19~+CD23~+B细胞百分率增高,B细胞表面CD23分布密度增高,CD3~+CD4~+T细胞百分率显著增高。与变应性鼻炎组大鼠(B组)相比,抗体干预组(C组)的喷嚏、挠鼻次数减少;皮下硬结稍小,染料扩散;鼻粘膜HE染色仍有嗜酸性粒细胞浸润,但有所减少,动静脉扩张程度及基底膜破坏程度减弱;免疫荧光发现CD23表达有所降低,CD19、IL-10表达稍增高;酶联免疫吸附试验ELISA检测显示总IgE、OVA-IgE、IL-4降低,IL-10、IFN-γ稍增高;CD19~+CD5~+CD1d~+B细胞百分率有所增高,CD19~+CD23~+B细胞百分率降低,CD3~+CD4~+T细胞百分率降低。鼻腔滴入组(C1组)与皮下注射组(C2组)相比,鼻腔滴入组局部症状好转明显,皮下注射组血清学指标好转明显。与对照组患者(甲组)相比,变应性鼻炎患者(乙组)鼻粘膜HE染色出现大量的嗜酸性粒细胞浸润,动静脉扩张、基底膜破坏明显;免疫荧光发现CD23表达增强,CD19、IL-10表达减弱;酶联免疫吸附试验ELISA检测显示总IgE、特异性IgE、IL-4增高,IL-10、IFN-γ降低;CD19~+CD5~+CD1d~+B细胞百分率降低,CD19~+CD23~+B细胞百分率增高,B细胞表面CD23分布密度增高,CD3~+CD4~+T细胞百分率增高。结论B细胞上的CD23表面密度与血清中IgE水平、IL-4呈正相关,与IL-10、IFN-γ呈负相关;可能通过依赖Bregs分泌IL-10介导的T细胞活化参与变应性鼻炎的发生发展;抗CD23抗体应用可调控变应鼻炎的症状和体征,皮下应用及鼻腔滴入局部症状改善情况未见明显差异,鼻腔滴入可作为抗CD23抗体应用的首选方法,抗CD23有望成为控制和治疗变应性鼻炎的新方法。抗CD23抗体在临床的应用具备可能性。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R765.21
【部分图文】：

模式图,变应性鼻炎,大鼠模型,模式图

41.3 变应性鼻炎及抗体干预的大鼠模型的制备图 1：变应性鼻炎大鼠模型造模模式图1)空白对照组（A 组）：本组大鼠于第 1、5、14、21 天给予大鼠氢氧化铝(40mg/kg)生理盐水溶液行腹腔注射，第 22-35 天以生理盐水双侧鼻腔滴鼻激发，50μl/侧，连续 14天。在第 36天给予生理盐水和 1%的 Evens 蓝混合液 0.1ml背部皮内注射作为阴性对照。2)变应性鼻炎组(B 组)：本组大鼠于第 1、5、14、21 天给予大鼠致敏原 OVA（40μg/kg）加入氢氧化铝佐剂(40mg/kg)溶于生理盐水溶液中进行 4 次腹腔注射进行基础致敏及强化致敏，随后即第 22-35 天，用 OVA（25mg/ml）进行鼻腔局部激发，50ul/侧，连续 14 天。在第 36 天给予含有 1mgOVA 和 1%的 Evens 蓝混合液 0.1ml 背部皮内注射。3)鼻腔滴入组（C1 组）：本组大鼠于第 1、5、14、21 天给予大鼠致敏原OVA（40μg/kg）加入佐剂氢氧化铝(40mg/kg)溶于生理盐水溶液进行 4 次腹腔注射的基础致敏及强化致敏

柱状图,大鼠,柱状图,鼻痒

结果动物试验结果1 变应性大鼠模型行为学观察评分空白对照组（A 组）大鼠几乎不出现鼻痒（2.67±1.231）、喷嚏（0.50±0.798）、流涕（0.08±0.289）等症状；变应性鼻炎组大鼠（B 组）出现明显的鼻痒（29.50±4.758）、喷嚏（71.58±4.542）及流涕（2.42±0.515）；鼻腔滴入组大鼠（C1）鼻痒（15.25±3.571）、喷嚏（44.25±5.910）、流涕（1.17±0.718），皮下注射组大鼠（C2）鼻痒（14.82±3.401）、喷嚏 C2（44.18±6.194）、流涕（1.09±0.701），抗体干预组症状较变应性鼻炎组明显好转,鼻腔滴入组与皮下注射组无明显差异。

柱状图,大鼠,实验结果,鼻粘膜

柱状图代表各组均数及标准差，各组大鼠背部肿块大小(mm)， *表示与正常对照组比较具有统计学意义，表示与变应性鼻炎组比较具有统计学意义（p<0.05），C1、C2 组未见明差异。3 大鼠鼻腔组织切片 HE 染色空白对照组大鼠（A 组）鼻粘膜嗜酸性粒细胞数目（1.58±1.165）,基底膜完整,未见明显血管扩张；变应性鼻炎大鼠（B 组）鼻粘膜嗜酸性粒细胞数目（21.17±1.946）,基底膜破坏,血管扩张明显；鼻腔滴入组（C1 组）鼻粘膜嗜酸性粒细胞数目（10.75±3.079）,基底膜破坏,血管扩张；皮下注射组（C2 组）鼻粘膜嗜酸性粒细胞数目（13.17±1.267）,基底膜破坏,血管扩张。

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