miR-30a在糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的表达及功能研究

发布时间：2020-09-08 10:30

　　研究背景糖尿病性白内障(diabetic cataract,DC)是糖尿病病人中发生较早的眼部并发症,是致盲的主要原因之一。糖尿病患者的年龄相关性白内障具有发病年龄早、晶状体混浊进展快以及容易成熟的特点。手术是白内障有效的治疗方式,尽管当前手术设备和技术都有很大的发展和提高,但糖尿病患者的手术并发症的发生率较高。随着糖尿病发病率不断增加,DC引起越来越多的重视,但其发病机制尚不明确。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)是指上皮细胞失去其正常分化表型,转化成为间质细胞的过程。目前研究认为,晶状体上皮细胞发生EMT和白内障的发病关系密切。自噬(autophagy)是细胞清除自身异常蛋白质和细胞器,以及回收利用营养物质的重要途径,对于维持细胞生存和发育极为重要。晶状体上皮细胞通过自噬-溶酶体途径可以清除细胞内累积的晶体蛋白和分化过程中的细胞器,维持细胞的正常形态和分化功能,这也是维持晶状体透明的重要手段。研究发现,自噬功能异常参与了多种白内障的发病过程。microRNAs(miRNAs)是一类内源性的非编码小RNAs,长度约22个核苷酸。miRNAs通过转录后水平调控靶基因的方式,在多个组织内对EMT和自噬相关通路发挥重要作用。因此,miRNAs对EMT和自噬的调控作用成为研究的新视角,同时miRNAs也成为治疗EMT和自噬失调疾病的潜在分子。研究发现,miRNAs与糖尿病性角膜病、原发性闭角型青光眼、视网膜疾病及白内障等眼部疾病的发生关系密切。但是,miRNAs在糖尿病性白内障中对EMT和自噬的调控机制尚无报道。通过miRNA芯片技术(miRNA microarray)可以筛选出正常晶状体和DC组织间差异表达的miRNAs,并对异常表达的miRNAs进行生物信息学预测和功能研究,有助于发现DC的发病机制。研究目的本研究运用DC晶状体上皮细胞的miRNAs表达谱和体外高糖模型,研究miR-30a对晶状体上皮细胞的EMT和自噬的调控机制,探讨其在DC发病过程中的作用。研究方法1.利用miRNA芯片技术,建立正常晶状体和DC晶状体上皮细胞的miRNAs表达谱,筛选差异表达的miRNAs(miR-30a),并进行实时荧光定量PCR验证。2.根据生物信息学数据库miRNA预测网站,预测miR-30a的靶基因,筛选其中与EMT和自噬相关的基因,进行双荧光素酶报告基因检测,明确miR-30a与预测靶基因的关系。3.运用免疫组织化学染色和Western blotting技术,检测上皮细胞标志物(E-cadherin)和EMT晚期标记物(vimentin和α-SMA)的表达;使用透射电镜技术观察自噬小体的形态。4.建立体外高糖模型,包括晶状体囊袋体外培养高糖模型和晶状体上皮细胞(HLECs-B3)高糖模型,从而模拟晶状体上皮细胞在体内的高糖状态。5.在体外高糖模型中,通过转染miR-30a模拟物和抑制物调节miR-30a的表达,进而达到调控EMT和自噬的目的。利用Western blotting和实时荧光定量PCR检测靶基因(SNAI1和BECN1)、EMT晚期标记物(vimentin和α-SMA)和自噬标记物(LC3BI和LC3BII)的蛋白和mRNA表达量;流式细胞仪检测晶状体上皮细胞的细胞凋亡率。研究结果第一部分miR-30a靶向结合SNAI1基因调控晶状体上皮-间质转化1.1糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中EMT和miR-30a的表达变化(1)通过免疫组织化学染色和Western blotting发现,与正常晶状体相比,DC晶状体上皮细胞的E-cadherin蛋白表达下降,而vimentin和α-SMA的蛋白表达则增高。(2)miRNA芯片结果显示,与正常晶状体上皮细胞相比,DC晶状体上皮细胞中有73个miRNAs表达增高2倍以上,199个miRNAs表达下降超过两倍,其中miR-30a表达下降约180倍。实时荧光定量PCR结果也验证了 miR-30a在DC晶状体上皮细胞中表达明显下降。1.2体外高糖模型的晶状体上皮细胞中EMT和miR-30a的表达变化(1)免疫组织化学染色显示,高糖刺激可以晶状体上皮细胞中的vimentin和α-SMA表达增高。(2)实时荧光定量PCR结果显示,体外高糖环境下,晶状体上皮细胞的miR-30a表达明显下降。由此可见,我们建立的晶状体囊袋体外培养高糖模型可以充分模拟DC晶状体上皮细胞在体内的状态。1.3 SNAI1基因是miR-30a的靶基因(1)通过生物信息学数据库miRNA预测网站(TargetScanHuman,http://www.targetscan.org/),预测 miR-30a 可以靶向结合于 SNAI1 的 3'UTR(706-713)。(2)双荧光素酶报告基因检测显示,当pmiR-RB-REPORT-SNAIl-3'UTR和miR-30amimic(模拟物)共表达时,荧光素酶活性明显下降;将SNAI1 3'UTR的结合位点突变,解除了 miR-30a对SNAI1的负性调控作用,荧光素酶活性增强。因此,研究表明SNAI1是miR-30a的靶基因。(3)晶状体囊袋体外培养高糖模型中,miR-30a可以直接调控SNAI1的表达。实时荧光定量PCR结果显示,miR-30amimic组中SNAI1的mRNA表达明显下降(mimic NC 作为对照,P0.05);miR-30a inhibitor(抑制物)组中 SNAI1的 mRNA 表达明显增多(inhibitor NC 作为对照,P0.05)。Western blotting 结果显示,miR-30amimic组中SNAI1的蛋白表达明显下降(mimicNC作为对照,P0.05);miR-30a inhibitor 组中 SNAI1 的蛋白表达明显增多(inhibitor NC 作为对照,P0.05)。1.4 miR-30a通过SNAI1基因负性调控EMT(1)Western blotting结果显示,miR-30a mimic可抑制高糖诱导的EMT晚期标记物vimentin和α-SMA的蛋白表达(mimic NC作为对照,P0.05)。(2)miR-30a mimic 可抑制 TGF-β 2 诱导的高 EMT 水平。Western blotting检测发现,加入TGF-β 2后vimentin和a-SMA的蛋白表达明显增高,说明高糖环境下TGF-β 2可诱导晶状体上皮细胞发生EMT;同时加入TGF-β 2和miR-30a mimic后,vimentin和α-SMA蛋白表达下降,EMT受到抑制。第二部分miR-30a靶向结合BECN1基因调控晶状体上皮细胞的自噬1.1糖尿病性白内障组织中miR-30a表达下降miRNA芯片结果显示,与正常晶状体上皮细胞相比,DC晶状体上皮细胞中miRNAs表达上调幅度最大的前5个miRNAs分别是miR-431-5p、miR-3169、miR-371a-3p、miR-1537和miR-593-3p,表达下调幅度最大的前5位分别是miR-30a-5p,miR-193a-3p,miR-204-5p,miR-184 和 miR-29b-3p。实时荧光定量PCR进行验证,结果与miRNA芯片一致,DC晶状体上皮细胞中miR-30a的表达明显下降。1.2糖尿病性白内障组织中自噬变化透射电镜结果显示,人DC晶状体上皮细胞中自噬小体体积增大,且单个自噬小体中包含多个待降解的线粒体。1.3 BECN1是miR-30a的靶基因(1)生物信息数据库(TargetScanHuman,http://www.targetscan.org/)预测,miR-30a可直接与BECN1的3'UTR(240-247)靶向结合。(2)双荧光素酶报告基因检测,当pmiR-RB-REPORT-BECN1 3'UTR和miR-30aagomir(模拟物)共表达时,荧光素酶活性明显下降;将BECN1 3'UTR的结合位点突变,可以解除miR-30a对BECN1的负性调控作用,荧光素酶活性增强。因此,研究表明BECN1是miR-30a的靶基因。(3)高糖培养环境下,miR-30a agomir可降低晶状体上皮细胞(HLECss-B3)中BECN1的蛋白表达量(agomirNC作为阴性对照,P0.05);相反,miR-30a antagomir(抑制物)可导致BECN1蛋白表达增高(antagomirNC作为阴性对照,P0.05)。1.4 miR-30a可抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞的自噬(1)高糖通过BECN1依赖途径诱导晶状体上皮细胞的自噬。LC3B是最重要的自噬标记物,LC3BD/LC3BI比值增大代表自噬小体形成增多,比值下降则代表自噬小体形成受损。高糖培养环境下晶状体上皮细胞中的LC3BII/LC3BI比值明显增大;加入BECNlsiRNA后,LC3BII/LC3BI比值下降。(2)miR-30a可抑制高糖诱导的自噬。转染miR-30a agomir后,LC3BII/LC3BIL比值明显下降(agomir NC作为对照组,P0.05);同时,LC3B的mRNA的表达也是下降(agomirNC作为对照组,P0.05)。1.5 miR-30a可抑制晶状体上皮细胞的凋亡。高糖培养环境下晶状体上皮细胞的凋亡增多,加入miR-30a agomir后发生凋亡的细胞减少(agomir NC作为对照组,P0.05)。结论1.正常晶状体和糖尿病性白内障晶状体上皮细胞中的miRNAs表达存在差异,其中miR-30a表达下降约180倍。2.晶状体囊袋体外培养高糖模型中,miR-30a通过靶向结合SNAI1基因,抑制晶状体上皮细胞EMT的发生。3.高糖培养环境下,miR-30a通过靶向结合BECN1基因,抑制晶状体上皮细胞的自噬。4.miR-30a可以抑制高糖诱导的晶状体上皮细胞的凋亡,对晶状体上皮细胞起保护作用。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R776.1;R587.2
【部分图文】：

晶状体,晶状体泡

图１．晶状体的发育［３５］。逡逑胚胎２２天，在前脑神经褶的区域，形成眼球的最初形态即视沟和视窝。２４逡逑天时视窝逐渐变深形成囊状凸起，称为视泡。２８天视泡的远端面向表皮外胚层逡逑方向接近，并在胚胎３２天时发生接触，此时外胚层细胞增厚形成晶状体板。３３逡逑天晶状体板从表皮外胚层分离，逐渐形成一个中空的晶状体泡，晶状体泡的前表逡逑面（ａｎｔｅｒｉｏｒｆａｃｅ）由一层立方上皮细胞组成，其后发育成前囊膜下的晶状体上皮逡逑细胞；与此同时视泡的远端面凹陷形成视杯，新形成的晶状体泡刚好位于视杯中；逡逑随后，呈凝胶状的原始玻璃体被分泌到晶状体泡和视杯间隙内；随着晶状体泡的逡逑发育，其逐渐被一层间充质囊包绕，称为晶状体囊膜，其前面是瞳孔膜。３３天逡逑开始，从晶状体泡后壁的细胞分化成前后走向的细长柱状细胞，形成晶状体泡的逡逑后壁（ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ邋ｆａｃｅ），在此过程中细胞核逐渐被降解；这些细胞也不断延长，形逡逑成高度透明的初级晶状体纤维细胞（ｐｒｉｍａｒｙ邋ｌｅｎｓ邋ｆｉｂｅｒｓ）。在胚胎７周后期初级晶逡逑状体纤维细胞逐渐填充并消除晶状体泡的空腔；位于晶状体前后极之间的晶状体逡逑边缘部被称为赤道区或赤道部，赤道部的细胞呈立方形，随着这些细胞的延长和逡逑细丢失，成为次级晶状体纤维细胞（ｓｅｃｏｎｄａｒｌｅｎｓ邋ｆｉｂｅｒｓ），次级晶状体纤逡逑

自噬,信号途径,伴侣,真核细胞

逦山东大学博士学位论文过Ｓｍａｄ和非Ｓｍａｄ途径诱导ＥＭＴ的发生［７９］。其中，Ｓｍａｄ信号可以通过调Ｓｎａｉｌ／Ｓｌｕｇ、ＺＥＢ１／２和Ｔｗｉｓｔ三个家族的转录因子，进而抑制上皮细胞标记物表达。ＴＧＦ－０有三个同源异构体０邋１、０邋２和０邋３，其中３邋２在眼组织中高度表达，逡逑可以引起晶状体细胞增殖、分化和凋亡异常，从而引起白内障［８０］。磷脂酰肌３激酶（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３－ｋｉｎａｓｅ，邋ＰＩ３Ｋ）是ＴＧＦ－Ｐ下游的信号分子，参与调细胞的分裂、分化和调亡。蛋白激酶Ｂ邋（ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ邋Ｂ，ＰＫＢ）也称为Ａｋｔ，逡逑可由ＰＩ３Ｋ激活，调控细胞生存。细胞在高糖环境下释放活性氧簇（ｒｅａｃｔｉｖｅ邋ｏｘｙｇｅｓｐｅｃｉｅｓ，邋ＲＯＳ），激活邋ＴＧＦ－０邋２／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ邋信号途径，诱导细胞发生邋ＥＭＴ［８１，８２］。逡逑在晶状体上皮细胞中，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途径在ＴＧＦ－邋０邋２诱导的ＥＭＴ过程中起重要作［８３，邋８４］。高糖可以激活ＬＥＣｓ中的ＡＲ活性，引起细胞发生氧化应激，细胞ＡＧＥ堆积；同时也激活ＴＧＦ－０邋２／ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信号途径，诱导ＥＭＴ的发生［７１］。逡逑ＡＧＥ也可以通过ＴＧＦ－０邋２诱导ＥＭＴ的发生，参与后发性白内障的形成［７５］。逡逑

自噬,营养物质循环,溶酶体,晶体蛋白

山东大学博士学位论文噬溶酶体、以及溶酶体将内容物降解。当ＵＬＫ１复合体（包括ＵＬＫ１激酶和逡逑物、Ａｔｇｌ３和ＦＩＰ２０００）被腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白质激酶（ａｄｏｒｏｓｍｅｏｎｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｋｉｎａｓｅ，ＡＭＰＫ）激活或被哺乳动物雷帕霉素耙蛋逡逑质（ｍａｍｍａｌｉａｎ邋ｔａｒｇｅｔ邋ｏｆ邋ｒａｐａｍｙｃｉｎ，ｍＴＯＲ）复合体邋１邋（ｍＴＯＲＣｌ）抑制时，逡逑以启动自嗤（Ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）；自嗤小体形成的前期阶段（Ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ），主要由Ｂｅｃｌｉｎｌ逡逑（即ＢＥＣＮ１）－Ｖｓｐ３４－Ａｔｇｌ４复合体介导完成；在自噻小体膜不断延长、成囊，微管相关蛋白邋１邋轻链邋３邋（ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋１邋ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３，ＬＣ３）被Ａｔｇ活化，与ＰＥ分子结合形成ＬＣ３ＩＩ，ＬＣ３ＩＩ则可与自噬小体的囊膜结合；逡逑后ＬＣ３ＩＩ通过与衔接蛋白ｐ６２结合，介导自噬小体与溶酶体融合［８７，邋８８］。＿逡逑

【参考文献】