氧诱导新生小鼠视网膜病变miRNA表达谱的初步研究
发布时间：2020-10-15 05:02
研究目的 本研究旨在对氧诱导的视网膜病变组织差异表达的miRNAs进行初步的研究，为进一步研究miRNAs对视网膜新生血管的调控机制奠定基础。 研究方法 本研究共分四个部分 第一部分：OIR模型制备。实验组采用C57BL/6J新生幼鼠，生后第7天饲养在75±2%氧浓度环境中5天，返回正常空气环境中继续饲养5天。对照组新生幼鼠在正常空气环境中饲养。实验组与对照组各随机选取24个视网膜组织进行下一步实验。 第二部分：OIR组织差异表达miRNAs的筛选。实验组与对照组随机各选10个视网膜标本进行混样，提取样本的总RNA，采用LC Sciences公司的uParaflo微流体miRNA芯片进行高通量筛选。根据预设条件，筛选出miRNAs作为研究对象进行第三部分研究。 第三部分：OIR组织差异表达miRNAs的初步验证。实验组与对照组随机各选20个视网膜标本，采用TaqMan qRT-PCR的方法对筛选出的两种候选miRNAs进行定量研究和验证，比较在两组间各miRNAs表达水平的差异是否与芯片结果一致。 第四部分：对筛选出差异表达的miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p进行生物信息学分析。 实验结果 第一部分：实验组与对照组通过眼球切片观察玻璃体腔突破视网膜内界膜内皮细胞核数目，以及高分子量荧光素灌注法观察视网膜血管形态，证实氧诱导视网膜病变模型的成功建立。 第二部分： 1、两组视网膜样本均可提取出合格的RNA 分别从实验组及对照组视网膜中提取总RNA，采用分光光度法检测OD260/280，比值均符合要求。 2、总RNA与miRNA芯片杂交 用实验组及对照组提取出的总RNA与miRNA芯片杂交，得到2张成像均匀、清晰的杂交图像，可证实总RNA中含有miRNAs。 3、miRNAs在实验组及对照组中表达存在差异 采用GenePix pro V6.0软件，对探针点的初始荧光强度进行分析，然后对初始强度值进行标准化处理，筛选出两组间差异表达的miRNAs。以表达水平变化倍数R≥2为界，共有31种差异表达的miRNAs，其中21种在实验组相对于对照组上调,10种下调。 4、筛选出两种候选miRNAs 以表达水平变化倍数R≥2为界，选择P值＜0.001以及信号值大于500，最后筛选出两种miRNA进行第三部分实验。 第三部分： 1、各视网膜标本中均可提取出合格的RNA 两组视网膜标本提取总RNA，OD260/280的比值均符合要求。 2、候选miRNAs的初步验证与筛选 以U6SnRNA为内参，对各miRNAs的表达水平进行标准化分析，通过统计学分析发现，第二部分实验中筛选出的miRNA-130a-3p、miRNA-5107-5p在视网膜组织中的表达存在显著性差异，与芯片结果一致。 第四部分：对miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p进行生物信息学分析，发现miR-5107-5p靶基因显著富集于ABC转运子,甲状腺癌通路。miR-130a-3p靶基因显著富集于甘油脂类代谢、内质网的蛋白加工、Notch信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、甘油磷脂代谢等通路中。 结论 1、通过氧诱导方法，可以成功建立OIR模型。 2、芯片检测发现，某些miRNAs的组织表达水平在实验组及对照组之间存在显著性差异,本实验筛选出67种差异表达的miRNA，其中35种在实验组相对于对照组上调,32种下调； 3、进一步筛选出两种miRNAs采用TaqMan RT-PCR进行验证，与芯片结果一致； 4、对miRNA-130a-3p和miRNA-5107-5p进行生物信息学分析，发现miR-5107-5p靶基因显著富集于ABC转运子,甲状腺癌通路。miR-130a-3p靶基因显著富集于甘油脂类代谢、内质网的蛋白加工、Notch信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、甘油磷脂代谢等通路中。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R774.1
【部分图文】：
图 1-1 200 倍 图 1-2图 1-3 400 倍 图 1-4 4图（1）（3）为对照组视网膜切片，未见突破内界膜验组视网膜切片，箭头处示突破视网膜内界膜内皮细2、突破内界膜内皮细胞核数目：
图 2-1 正常对照组芯片扫描图 图 2-2 OIR 组芯片扫描图3.对扫描图像的统计分析将采集到的荧光数据通过 GenePix pro V6.0 软件整理，得到各探针点荧光强度值。 取每条探针三个重复点位的平均值为该探针的荧光强度。背景值即得到信号均值用来筛选差异表达的 miRNAs。表 2-1 差异表达的 miRNAs名 称 P 值 对照组信号均值 实验组信号均值 差倍miRNA-3962 9.94E-06 74 523 7.miRNA-5121 2.19E-04 630 375 -1miRNA-16-5p 2.89E-04 3193 1802 -1miRNA-130a-3p 4.12E-04 1010 505 -2miRNA-181b-5p 4.42E-04 2011 2846 1.miRNA-let-7j 5.50E-04 344 564 1.miRNA-9-5p 6.24E-04 1044 2181 2.
图 2-1 正常对照组芯片扫描图 图 2-2 OIR 组芯片扫描图3.对扫描图像的统计分析将采集到的荧光数据通过 GenePix pro V6.0 软件整理，得到各探针点荧光强度值。 取每条探针三个重复点位的平均值为该探针的荧光强度。背景值即得到信号均值用来筛选差异表达的 miRNAs。表 2-1 差异表达的 miRNAs名 称 P 值 对照组信号均值 实验组信号均值 差倍miRNA-3962 9.94E-06 74 523 7.miRNA-5121 2.19E-04 630 375 -1miRNA-16-5p 2.89E-04 3193 1802 -1miRNA-130a-3p 4.12E-04 1010 505 -2miRNA-181b-5p 4.42E-04 2011 2846 1.miRNA-let-7j 5.50E-04 344 564 1.miRNA-9-5p 6.24E-04 1044 2181 2.
本文编号：2841734
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R774.1
【部分图文】：
图 1-1 200 倍 图 1-2图 1-3 400 倍 图 1-4 4图（1）（3）为对照组视网膜切片，未见突破内界膜验组视网膜切片，箭头处示突破视网膜内界膜内皮细2、突破内界膜内皮细胞核数目：
图 2-1 正常对照组芯片扫描图 图 2-2 OIR 组芯片扫描图3.对扫描图像的统计分析将采集到的荧光数据通过 GenePix pro V6.0 软件整理，得到各探针点荧光强度值。 取每条探针三个重复点位的平均值为该探针的荧光强度。背景值即得到信号均值用来筛选差异表达的 miRNAs。表 2-1 差异表达的 miRNAs名 称 P 值 对照组信号均值 实验组信号均值 差倍miRNA-3962 9.94E-06 74 523 7.miRNA-5121 2.19E-04 630 375 -1miRNA-16-5p 2.89E-04 3193 1802 -1miRNA-130a-3p 4.12E-04 1010 505 -2miRNA-181b-5p 4.42E-04 2011 2846 1.miRNA-let-7j 5.50E-04 344 564 1.miRNA-9-5p 6.24E-04 1044 2181 2.
图 2-1 正常对照组芯片扫描图 图 2-2 OIR 组芯片扫描图3.对扫描图像的统计分析将采集到的荧光数据通过 GenePix pro V6.0 软件整理，得到各探针点荧光强度值。 取每条探针三个重复点位的平均值为该探针的荧光强度。背景值即得到信号均值用来筛选差异表达的 miRNAs。表 2-1 差异表达的 miRNAs名 称 P 值 对照组信号均值 实验组信号均值 差倍miRNA-3962 9.94E-06 74 523 7.miRNA-5121 2.19E-04 630 375 -1miRNA-16-5p 2.89E-04 3193 1802 -1miRNA-130a-3p 4.12E-04 1010 505 -2miRNA-181b-5p 4.42E-04 2011 2846 1.miRNA-let-7j 5.50E-04 344 564 1.miRNA-9-5p 6.24E-04 1044 2181 2.
本文编号：2841734
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