丹参素钠通过抑制下丘NMDA受体活性减轻水杨酸钠引发的耳鸣

发布时间：2020-10-17 02:38

　　 目的耳鸣作为临床常见病症,常使患者异常痛苦但尚无理想愈手段。耳鸣发生与听觉传导通路任何一处的兴奋性增高相关。下丘(inferiorcolliculus,IC)作为听觉传导通路的重要中继站,其兴奋-抑制失衡是导致耳鸣发生的重要机制。下丘兴奋性谷氨酸能神经系统过度兴奋或抑制性GABA能神经系统兴奋性降低,均可通过局部神经环路的放大而产生严重耳鸣。我们研究发现丹参的有效成分丹参素钠(SodiumDanshensu,SDSS)具有抑制下丘NMDA受体活性的作用,因而我们推测SDSS能通过抑制NMDA受体起到抑制耳鸣的作用。方法1.电生理实验制作下丘脑片,药理学分离出NMDA受体及GABAA受体,膜片钳全细胞记录正常、灌流SS(1mM)以及灌流SS和SDSS(100mM)时NMDA受体电流,记录正常和灌流SDSS(1OOmM)时NMDA受体、GABAA受体电流。2.体外培养8-11天的下丘神经元,分为Control组、SS组、SS+APV组、SS+SDSS 组、NMDA 组、NMDA+APV 组、NMDA+SDSS 组、NMDA+SS 组、NMDA+SS+SDSS组,进行相应处理后用hocheast33342染色,计数细胞凋亡率。收集细胞处理上清液,检测其中LDH释放量。3.出生后6～7周听力正常的C57BL/6雄鼠随机分为Control组、SS组、SS+SDSS组,每组21只,其中15只用于行为学实验,6只用于ABR测听。SS组使用SS400mg/kg连续九天腹腔注射制作耳鸣模型,SDSS+SS组中SDSS先于SS前0.5h注射,Control组注射等量生理盐水。每只小鼠于打药前后各测一次旷场、高架、强迫游泳实验评估情绪改变,各测一次ABR听阈,评估听力情况。4.将3组实验后小鼠断头处死,取下丘脑组织,并提取蛋白质,western blotting法分别检测NR2A-2D4种亚基在膜上的表达以及凋亡执行蛋白活化型caspase3的表达。结果1.对于下丘分离出的NMDA受体电流,灌流SS后幅值增加至对照的139.6±5.5%,而灌流SDSS后幅值减小为对照的67.6±3.59%,同时灌流SS和SDSS时电流幅值为对照的96.5±4.3%,而SDSS对GABAA受体电流几乎无影响(为对照的98.2±2.9%)。SS增强了 NMDA受体电流,而SDSS抑制NMDA受体电流,并消除SS对NMDA电流增大部分。2.对于体外培养的下丘神经元,SS引起的神经元死亡增加(凋亡率从8±0.5%到34.6±1.6%,LDH相对于control释放量为1.3)能被NMDA受体抑制剂APV抑制(凋亡率14.4±0.3%,LDH为1.1),也能被SDSS减轻(凋亡率18.0±1.8%,LDH为1.1),SS通过NMDA受体导致神经元的兴奋性死亡;SS能够增强NMDA对下丘神经元的兴奋毒性(凋亡由41.6±1.2%升到53.1±1.1%,LDH为control 1.7倍),SDSS则明显抑制SS和NMDA两者共同对神经元的损伤(凋亡从53.1±1.1%降至 17.7±0.7%,LDH 为 1.3)。3.SS耳鸣模型小鼠(n=15)在旷场中央区的活动时间(47.1±8.5s)活动距离(429.6±68.8cm)均较实验前(80.6±7.5s;775.0±68.5cm)明显减少,进入高架开放臂的次数(2.3±0.6)和活动时间(10.8±3.8s)较实验前(6.0±0.9;33.1±6.0s)也显著减少,在水中的不动时间明显增加(从100.5±13.3s到138.7±14.5s),表现出明显的焦虑抑郁情绪。而SDSS+SS组(n=15)小鼠实验前后在旷场中央区、高架开放臂活动情况相似,在水中的不动时间也无明显差异,SDSS有效消除了耳鸣引发的焦虑抑郁情绪。4.SDSS抑制了 SS对NR(2A、2B、2D)三种亚基的表达的增加,对活化型caspase3的增加,有效减少了下丘脑组织神经元的凋亡。结论1.SS能够增强下丘NMDA受体活性,抑制GABA受体活性,破坏下丘兴奋抑制平衡,使下丘兴奋性显著升高,是SS引发耳鸣的重要机制。2.SDSS对下丘NMDA受体活性具有抑制作用,但这种抑制是不完全的。SDSS对GABAA受体活性无影响。3.SDSS可以通过抑制SS引起的NMDA受体过度兴奋,缓解小鼠下丘兴奋抑制失衡,保护下丘脑组织,而减轻SS引发的耳鸣及听力损失。
【学位单位】：滨州医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R764.45
【部分图文】：

图１?（ａ、ｂ）?ＳＤＳＳ抑制ＮＭＤＡ受体介导的电流对ＧＡＢＡ受体电流无影响。下丘脑片上药??理学分离并记录ＮＭＤＡ受体、ＧＡＢＡａ受体介导的电流。当灌流ＳＤＳＳ后，ＮＭＤＡ受体介导??电流幅值减少（“＊”：?ｐ＜〇．〇５），而ＧＡＢＡａ受体介导电流幅值基本不变，洗脱ＳＤＳＳ后，电流??恢复正常。（ｃ）?ＳＳ增强下丘ＮＭＤＡ受体介导的电流。下丘脑片上药理学分离并记录ＮＭＤＡ??受体介导的电流，灌流ＳＳ?（ＩｍＭ）后，ＮＭＤＡ诱发ＮＭＤＡ受体产生电流幅值增加（“＊＊”：??ｐ＜０．０１），洗脱ＳＳ后，电流幅值恢复正常。（ｄ）?ＳＤＳＳ消除ＳＳ对ＮＭＤＡ电流增大部分。??下丘脑片分离ＮＭＤＡ受体，记录灌流ＳＤＳＳ后的电流，再同时灌流ＳＳ后，ＮＭＤＡ诱发ＮＭＤＡ??受体电流无明显改变。??１８??

探索活动更少，因而进入高架十字迷宫开放臂和旷场中央区的活动会明显减少。我??们发现，ＳＳ耳鸣模型小鼠实验后相对实验前进入高架开放臂（垂直方向）和旷场??中央区的活动明显减少（图３?ａ、ｄ），统计分析，相对于实验前进入开放臂的次数??（６．０±０．９）和时间（３３．１±６．０?ｓ），实验后明显减少，分别为２．３±０．６?（ＭＥＡＮ±ＳＥ，??ｎ＝１５，与实验前比?ｐ＜〇．〇〇ｌ）和?ｌ〇．８±３．８ｓ?（ＭＥＡＮ土ＳＥ，?ｎ＝１５，实验前比?ｐ＜０．００１）??（图４ｂ、ｃ）。相对于实验前进入中央区的时间（８０．６±７．５ｓ）和距离（７７５．０±６８．５ｃｍ），??实验后也明显减少，分别为４７．１±８．５ｓ?（ＭＥＡＮ±ＳＥ，ｎ＝１５，与实验前比ｐ＜０．０１）和??４２９．６±６８．８ｃｍ?（ＭＥＡＮ土ＳＥ，ｎ＝１５，与实验前比ｐ＜０．００１）（图?３ｅ、ｆ），小鼠表现出??了明显的焦虑行为。预先用ＳＤＳＳ保护的小鼠，以及正常对照小鼠，各自实验前后??进入开放臂和中央区的活动情况相似（图３?ａ、ｄ），进入开放臂次数和时间，进入??中央区时间和距离四个指标结果实验前后也无统计学差异（图３?ｂｅｅｆ）

力受损更为严重为特征［ＩＧ］。为了探宄ＳＤＳＳ是否对ＳＳ耳鸣模型小鼠的听力也有保??护作用，我们测定了小鼠分别在ｃｌｉｃｋ、８ｋ、１６ｋ、３２ｋ四种刺激声下的ＡＢＲ阈值。??从ＡＢＲ波形图中（图４?ａ、ｂ），?ＳＳ组小鼠阈值明显增加。而ＳＤＳＳ组实验前后阈??值相当。统计结果中（图４ｃ、ｄ），四种声音下，ＳＳ组小鼠实验后阈值均显著增加，??ｃｌｉｃｋ、８ｋ、１６ｋ、３２ｋ?阈值增加分别为?１８．丨±丨?＿７ｄＢ，?２２．２±１．７?ｄＢ，３１．９±丨．９?ｄＢ，?３０．９±１．０??ｄＢ。且高频听力损失更严重。而Ｃｏｎｔｒｏｌ、ＳＤＳＳ各组实验后阈值升高较小
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本文编号：2844147