TNF-α在干眼症患者结膜细胞的表达和对人眼结膜细胞NHE8的调节作用

发布时间：2020-10-21 15:16

　　目的干眼是多因素疾病，炎症作为一种防御反应，是干眼最常见的病理表现。研究表明在干眼症患者泪液和结膜上皮细胞中，炎症因子TNF-α水平升高[1]。通过对干眼症病人年龄、性别和干眼症状的分析，以及对结膜上皮细胞内TNF-α的监测，探讨干眼症病人眼表的炎症状态和临床体征的关系。钠/氢交换体8（NHE8）是一种新型蛋白，其生理作用是通过细胞内质子与细胞外钠离子进行等比例的跨膜交换，从而调节pHi（细胞内pH）稳定，维持细胞体积，协同HCO-+3、NH4、Cl-等电解质的离子转运。NHE8蛋白主要分布在小肠刷状缘，在肠道炎症腹泻中NHE8蛋白表达受TNF-α、干扰素-γ等炎性因子的抑制[2]。我们将小肠与结膜中钠/氢交换体-8的表达进行比较，意外地发现在结膜细胞内NHE8高表达。本实验探讨在离体结膜细胞中，TNF-α对NHE8蛋白的调节作用，进一步完善NHE8在眼表细胞中的研究。方法 1.病例来自沈阳军区总医院眼科2012年10月~2013年1月门诊，以干眼为主诉的患者，做如下体征检测：泪液分泌实验（Schirmer’s Test），角膜荧光素钠染色，BUT。 2.确诊干眼症病人并随机选取16人，在确诊无干眼症的门诊患者中随机选取16人，分别作为病例组和对照组。 3.用结膜印迹细胞法分别收集两组结膜细胞，提取RNA，反转录后做实时定量PCR，检测结膜中TNF-α表达水平。 4.免疫组织化学染色分析NHE8蛋白在人眼结膜的分布情况。 5.细胞培养技术。 6.细胞免疫荧光染色。 7.信使RNA提取及蛋白提取技术，实时定量PCR和Western Blot。 8.构建报告基因重组质粒。 9.瞬时转染和功能性启动子分析。 10.采用Stata12.0总计软件，计量资料比较用t检验，两样本率比较用卡方检验，指标间相关性采用线性相关分析。P0.01表示差异有统计学意义。结果 1.以干眼症主诉就诊的门诊患者中: （1）干眼症患病率为49%。（2）其中45~50岁患者患病率达到相对峰值。（3）女性患病人数明显多于男性，卡方检验χ2=29.78，P0.01。（4）病例组结膜上皮细胞内TNF-α表达量高于对照组，t=7.31，P0.01。（5）干眼症患者结膜细胞内，TNF-α表达与Schirmer’s Test成负相关 R2=0.2583，p=0.000000.01；TNF-α表达与BUT成负相关R2=0.1435，p=0.0000490.01。（6）人眼结膜细胞内，NHE8蛋白初步定位于细胞膜上。 2.在人眼结膜上皮细胞系（CCL-20.2）中：（1）通过对NHE8蛋白和细胞核共免疫荧光染色，观察到NHE8蛋白定位于质膜；（2）不同浓度TNF-α抑制NHE8蛋白表达程度不同，25ng/ml TNF-α作用于结膜细胞，NHE8信使RNA含量与未处理组相比下降25%，t=4.69，P0.01，结果有显著差异；50ng/ml TNF-α处理细胞，NHE8信使RNA含量表达下降32%，t=7.31，P0.01，结果有显著差异；100ng/ml TNF-α培养细胞，NHE8信使RNA含量表达下降54%，t=7.31，P0.01，结果有显著差异。（3）在蛋白水平，三种不同浓度TNF-α处理细胞，NHE8蛋白表达均下降，TNF-α为25ng/ml时，NHE8蛋白含量与未处理组相比下降37%，t=7.31，P0.01，结果有显著差异；浓度为50ng/m时，NHE8蛋白表达下降54%，t=7.31，P0.01，结果有显著差异；100ng/ml TNF-α培养细胞，NHE8但你白表达下降75%，t=7.31，P0.01，结果有显著差异。（4）通过TNF-α浓度梯度实验对NHE8基因在转录水平和蛋白水平表达的影响，确定上药浓度为25ng/ml。（5）使用放线菌素D（Actinomycine D，AD）处理细胞，发现TNF-α对NHE8表达的抑制作用体现在基因转录水平。在TNF-α或AD处理下的结膜细胞中，NHE8表达减少量没有统计学差异，在同时用TNF-α和AD处理后的细胞中，NHE8表达与单独处理后表达没有统计学差异，说明TNF-α抑制NHE8蛋白表达是通过抑制NHE8mRNA合成实现的。（6）使用人NHE8基因重组质粒转染细胞，发现TNF-α抑制NHE8基因启动子序列在-671bp~-89bp之间。结论 1.统计沈阳军区总医院眼科门诊2012年10月~2013年1月期间，干眼症病人数占总就诊人数比例为48%，提示门诊干眼症患者患病率较高 2.患病率与年龄、性别有极大相关性 3.干眼症病人结膜细胞内TNF-α含量增高至45%，提示炎症参与干眼症疾病过程 4. TNF-α表达与Schirmer’s Test、BUT呈线性负相关，提示TNF-α在眼表的表达与干眼症病情严重程度相关， 5.钠/氢交换体（NHE8）8在人眼结膜细胞内高表达，且分布于结膜细胞质膜上。 6.体外实验证实，炎症因子TNF-α能够诱导结膜细胞的炎症反应，抑制NHE8基因启动子活性，定位于NHE8基因的-671bp~-89bp启动子区域。
【学位单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2014
【中图分类】：R777.34
【部分图文】：

病例,结膜上皮细胞,含量测定,统计学意义

正常组和病例组Schirmer’s Test和BUT实验结果比表 8 正常组和病例组 Schirmer’s Test 和 BUT 试验结果比较Schiemer’s Test（mm） 13.5±0.59 4.7±0.53 10.13 0.0000 迹法取组织及 TNF-α 实时定量 PCR 反应结果迹法，测得结膜上皮细胞 TNF-α基因含量测定如t=-7.31，P=0.0000（<0.01），差异具有统计学意义胞内 TNF- α基因表达明显高于对照组。

相关性,相关性分析,结膜,干眼症

TNF-α为细胞内 TNF-α mRNA 表达量。每组 RNA 分别检测基因 TNF-α/TBP（内标）结膜细胞中的表达含量。数据通过 3 次重复试验的（mean±SE）汇总， * 代表 P<0.01与对照组的比较）4) 病例组 TNF-α 基因表达与 Schirmer 试验、BUT 的相关性分析通过相关性分析，结果显示在干眼症患者结膜细胞内，TNF-α表达与hirmer s Test 成负相关（R2=0.2583，p=0.00000<0.01，差异具有统计学意义）；NF-α表达与 BUT 成负相关（R2=0.1435，p=0.000049<0.01，差异具有统计学意）。如表 9，图 2、3。表 9 TNF-α 与 SchirmerTest、BUT、TNF-α 的相关性分析表Schirmer’s Test BUT0.2583 0.14350.000000 0.000049