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Arg9-EGFP绿色荧光蛋白的穿膜效果研究

发布时间:2017-10-12 11:28

  本文关键词:Arg9-EGFP绿色荧光蛋白的穿膜效果研究


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【摘要】:药物分子进入细胞是药物投递系统中非常重要的一个环节。哺乳动物细胞有膜的存在,使蛋白质、核酸类等许多具有生物活性的大分子药物无法直接进入细胞,导致此类药物在实际使用中出现许多局限,难以起到治疗效果。细胞穿膜肽能携带多种活性目的分子高效进入细胞。近20年来,多种细胞穿膜肽被陆续证实并报道。对细胞穿膜肽结构及生物化学性质的研究,发现细胞穿膜肽具有以下共同特性:(1)都包含一段长短不一的正电荷多肽,富含精氨酸和赖氨酸等碱性氨基酸;(2)穿膜肽二级结构中都存在α-螺旋空间结构。其中,富含精氨酸的穿膜多肽被深入研究,发现一段单独的多聚精氨酸就能够顺利实现跨膜,其穿膜效应不具有细胞选择性,使之成为目前应用最广泛的一类穿膜肽。为实现外源蛋白有效穿膜的过程,本文探讨了细胞穿膜肽Arg9介导的绿色荧光蛋白蛋白的穿膜作用。通过构建p ET-15b-Arg9-EGFP原核表达载体,利用适宜浓度的IPTG诱导DE3大肠杆菌原核表达体系以及His标签纯化系统,纯化获得Arg9-EGFP蛋白;运用乳腺癌MCF-7细胞模型,检测Arg9穿膜肽的穿膜效果。实验结果表明,我们成功制备了Arg9-EGFP融合蛋白。与不含Arg9穿膜肽的EGFP蛋白相比,Arg9-EGFP融合蛋白可有效穿膜进入细胞内部,并显示剂量依赖性。荧光检测结果表明,进入细胞的Arg9-EGFP蛋白主要聚集在细胞浆内。本研究表明Arg9细胞穿膜肽可以有效介导目标蛋白进入细胞,并保持目标蛋白的大分子活性,有望成为实现特定蛋白穿膜并发挥药物作用的潜在工具,为蛋白类新型药物的投递方式带来新思路。
【关键词】:质粒 穿膜肽 融合蛋白 蛋白纯化
【学位授予单位】:湖南大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:R945
【目录】:
  • 摘要5-6
  • Abstract6-10
  • 第1章 绪论10-21
  • 1.1 前言10-11
  • 1.2 Arg9穿膜肽的简介11-12
  • 1.3 穿膜肽的穿膜机制12-15
  • 1.3.1 穿膜肽胞吞作用机制13-14
  • 1.3.2 富含精氨酸类细胞穿膜肽的直接穿膜机制研究14-15
  • 1.4 细胞穿膜肽面临的挑战和问题15-17
  • 1.5 穿膜肽的应用现状及前景17-19
  • 1.6 选题背景及内容提要19-21
  • 1.6.1 选题背景19-20
  • 1.6.2 本文主要研究内容20-21
  • 第2章 Arg9-EGFP融合蛋白的原核表达体系的构建21-28
  • 2.1 前言21
  • 2.2 实验试剂21-22
  • 2.3 实验仪器22
  • 2.4 pET-15b-EGFP、pET-15b-Arg9-EGFP质粒构建22-23
  • 2.5 pET-15b-EGFP、pET-15b-Arg9-EGFP质粒构建23-25
  • 2.6 实验结果与分析25-26
  • 2.6.1 EGFP和Arg9-EGFP目的片段的扩增25-26
  • 2.6.2 重组质粒酶切鉴定琼脂糖电泳结果26
  • 2.7 本章小结26-28
  • 第3章 EGFP、Arg9-EGFP融合蛋白的原核诱导表达28-34
  • 3.1 前言28
  • 3.2 实验试剂28-29
  • 3.3 实验仪器29
  • 3.4 实验方法29-32
  • 3.4.1 EGFP、Arg9-EGFP融合蛋白的原核诱导表达时间的摸索29-31
  • 3.4.2 EGFP、Arg9-EGFP融合蛋白的诱导、表达、提取和纯化;31-32
  • 3.5 实验结果与分析32-33
  • 3.5.1 蛋白表达体系的诱导时间摸索32-33
  • 3.5.2 纯化蛋白以及其SDS-PAGE纯度分析33
  • 3.6 本章小结33-34
  • 第4章 Arg9-EGFP绿色荧光蛋白的穿膜效果研究34-42
  • 4.1 前言34
  • 4.2 实验仪器34
  • 4.3 实验材料34-35
  • 4.4 实验方法35-39
  • 4.4.1 细胞复苏35
  • 4.4.2 细胞传代35-36
  • 4.4.3 细胞冻存36
  • 4.4.4 细胞计数36
  • 4.4.5 Arg9-EGFP绿色荧光蛋白处理细胞36-37
  • 4.4.6 Hoechst染色37
  • 4.4.7 Western Bloting(WB)37-39
  • 4.5 实验结果与分析39-40
  • 4.5.1 荧光显微镜检测穿膜肽穿膜效率39-40
  • 4.5.2 免疫印迹检测穿膜肽穿膜效率40
  • 4.6 本章小结40-42
  • 结论与展望42-44
  • 参考文献44-51
  • 附录A 英文缩写51-52
  • 附录B 常用试剂与缓冲溶液配方52-53
  • 附录C 攻读学位期间所发表的学术论文53-54
  • 致谢54

【参考文献】

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1 ;Baculoviruses as Vectors in Mammalian Cells[J];Virologica Sinica;2007年02期



本文编号:1018444

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