还原响应型金纳米粒药物载体系统的设计和克服肿瘤多药耐药性的研究

发布时间：2018-03-14 03:26

本文选题：抗肿瘤　切入点：阿霉素　出处：《第二军医大学》2014年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在肿瘤的化学治疗中,肿瘤细胞对长期使用的抗肿瘤药物产生耐药性是肿瘤治疗领域的一大障碍。目前大多数观点认为,肿瘤细胞多药耐药性的产生与肿瘤细胞外排泵蛋白如P-gp糖蛋白和多药耐药蛋白(MRP)等的过量表达有关。过量表达的P-gp糖蛋白对游离的抗肿瘤药物进行识别,将通过被动扩散进入肿瘤细胞内部的游离药物又排出泵外,细胞内部药物浓度偏低而不能杀死肿瘤细胞,最终导致耐药性。现阶段能克服肿瘤多药耐药的纳米载药系统主要包括：脂质体、聚合物胶束、聚合物纳米粒、无机纳米药物载体等。本课题设计了一种载药系统来规避外排泵蛋白对药物的识别,逆转肿瘤的多药耐药性,为克服肿瘤多药耐药这一难题开展一些探索。阿霉素是蒽环类抗生素,是一种作用于DNA的抗肿瘤药物,其抗菌谱广,广泛应用于肿瘤治疗,因此本课题采用阿霉素作为模型药物进行研究。以阿霉素为模型药物的载药系统主要有脂质体、胶束、聚合物载体等,利用这些纳米载药系统克服肿瘤多药耐药取得了一定的效果。目前多种针对细胞内微环境刺激响应释放的载药系统被设计出来,其中谷胱甘肽还原响应型释放载药系统更是成为研究热点。本课题设计了谷胱甘肽还原响应型释放载药系统以达到即可以规避外排泵识别药物,逆转多药耐药,又可以响应细胞内环境使药物达到控释的效果。该载药系统的设计思路是：以粒径可控、生物相容性良好的金纳米粒为载药核心,通过化学反应合成含有游离巯基的巯基化阿霉素,金纳米粒与巯基化阿霉素共价键结合形成载药金纳米粒,为促进载药金纳米粒更好的进入细胞,通过静电作用在其表面引入生物可还原型的聚酰胺-胺类阳离子材料,构建了具有谷咣甘肽还原响应型的ss-PAA包覆的金纳米粒载药系统。本文从四部分阐述了ss-PAA包覆的金纳米粒载药系统的构建及其谷胱甘肽刺激响应的释放行为及逆转肿瘤多药耐药的研究。论文的第一部分首先是材料的制备及表征,这一部分包括了载药核心金纳米粒的制备及表征、谷胱甘肽还原响应型阳离子材料ss-PAA的制备及表征。本课题采用柠檬酸三钠还原法制备金纳米粒,通过激光粒度仪、紫外分光光度计、透射电子显微镜表征金纳米粒的粒径、电位、SPR特征吸收峰以及形态。实验结果显示,柠檬酸三钠还原法制备的金纳米粒粒径18±2.3nm,电位-38.4±4.3mV,在波长为523nm处存在SPR特征吸收峰,形态为规则的球形颗粒并且粒径均匀,纳米粒之间无粘连现象。ss-PAA的制备则由4-氨基-1-丁醇(ABOL)和胱胺双丙烯酰胺(CBA)发生迈克尔加成反应聚合而成,利用核磁手段对其分子结构进行了表征,证明ss-PAA成功合成。第二部分,首先采用化学合成方法对阿霉素进行巯基化修饰,通过核磁、质谱和高效液相色谱图谱对合成的巯基化阿霉素进行分析,核磁图谱显示巯基阿霉素特征峰的质子信号存在,质谱结果显示阿霉素分子离子峰由544增至616；高效液相色谱结果显示,阿霉素的出峰时间由7min左右变至10min左右,表明巯基化阿霉素合成成功。借助荧光分光光度法和高效液相色谱法建立了巯基化阿霉素的含量测定方法。实验结果显示,巯基化阿霉素浓度在0.25～16μg·mL-1范围内与样品吸光度值及色谱峰面积呈良好的线性关系R2分别为0.9997和0.9998,直线回归方程分别为：C=0.0066A-0.0211和C=0.0002A-0.2204,经验证方法的线性、精密度、准确度、专属性均符合测定要求,为后期实验中测定巯基化阿霉素的吸附量和吸附效率以及巯基化阿霉素的谷胱甘肽还原响应释放提供了测定依据。第三部分构建了谷胱甘肽还原响应型金纳米颗粒载药系统,并对该载药系统进行表征及对载药系统的载药量、载药效率及体外释放进行了考察。金纳米粒吸附巯基化阿霉素及ss-PAA之后,粒径逐渐增大,由18±2.3nm增至80.5±6.8nm,电位也由-38.4±4.3mV转变为22.3±5.2mV。紫外光谱分析表明,金纳米粒吸附巯基化阿霉素和ss-PAA之后,最大吸收波长出现2-3nm的红移现象,证明载药系统的成功构建。采用荧光分光光度法对金纳米粒吸附巯基阿霉素的吸附量和吸附效率进行考察,实验结果显示,巯基化阿霉素浓度在0.25～16μg·mL-1范围内与荧光吸光度值A呈良好的线性关系(r=0.9998),线性回归方程为C=0.0002A-0.2204。经测定,方法的精密度、准确度、回收率等均符合药物含量测定的要求。逐渐增大金纳米粒／巯基阿霉素的摩尔比,未被吸附的上清液中游离的巯基化阿霉素的峰面积及荧光强度逐渐降低,表明随着金纳米粒的摩尔浓度增加,吸附的巯基化阿霉素的量也相应增加。当金纳米粒的摩尔浓度为7.5nM时,吸附的巯基阿霉素为10.84μ M。用谷胱甘肽(GSH)对载药系统进行处理,结果表明,在GSH存在条件下,阿霉素能迅速从载药系统中得以释放。第四部分以乳腺肿瘤细胞系MCF-7的敏感细胞和耐药细胞为研究对象,采用CCK8法比较了载药系统对MCF-7敏感细胞和耐药细胞的细胞毒性,在MCF-7敏感细胞中,DOX、DOX-SH@Au.DOX-SH@Au@ss-PAA的IC50值分别是0.74±0.15、10.52±1.21、2.58±0.24μ M,游离巯基阿霉素的细胞毒性分别强于金纳米粒载巯基阿霉素组和ss-PAA包覆的金纳米粒载筑基阿霉素组,而在耐药细胞中,DOX、 DOX-sH@Au.DOX-SH@Au@ss-PAA的IC50值分别是2.53±0.21、11.58±1.42、1.91±0.17u M,ss-PAA包覆的金纳米粒载巯基阿霉素组的细胞毒性均强于游离药物组和金纳米粒载巯基阿霉素组。两种细胞经过GSH处理后,载药系统对两种细胞的细胞毒性均强于未用GSH处理组。通过激光共聚焦显微镜和流式细胞技术观察了载药系统对GSH的响应释放情况,实验结果均表明,加入GSH之后,阿霉素的荧光显著增强,表明载药系统能够在细胞内GSH的刺激下响应释放阿霉素。在对耐药细胞的观察中,加入GSH后,载药金纳米颗粒组和包覆ss-PAA的载药金纳米颗粒组的荧光明显强于游离巯基阿霉素组,表明载药系统能规避外排泵蛋白的识别,将更多的阿霉素载入细胞。本课题针对肿瘤多药耐药性的难题,设计了细胞内谷胱甘肽响应性的金纳米粒载药系统,研究表明了我们设计的载药系统能在谷胱甘肽的刺激响应下释放阿霉素,增加阿霉素在细胞内的浓度,在一定程度上能够逆转肿瘤的多药耐药性,对改善肿瘤的化学治疗具有一定意义。
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【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R91;R96

【参考文献】