胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用

发布时间：2018-06-17 14:06

本文选题：镉 + 肾小管上皮细胞　；参考：《山东农业大学》2017年硕士论文

【摘要】：镉是环境中一种常见的重金属污染物,对机体的损伤呈多系统性和多器官性。肾脏是镉毒性损伤的重要靶器官,而肾小管是镉肾毒性损伤的靶部位。前期研究表明,氧化应激所介导的细胞凋亡在镉染毒所致原代大鼠肾小管上皮细胞毒性损伤中发挥主导作用,且该过程中伴随着胞浆钙超载。钙离子(Ca2+)作为一种重要的胞内第二信使,对细胞凋亡和细胞自噬具有重要的调控作用。然而,镉暴露所致胞浆钙超载的来源、Ca2+对镉所诱导肾小管上皮细胞凋亡及细胞自噬的调控作用尚未见报道。鉴于此,本论文重点研究胞内钙重分布在镉所诱导大鼠肾小管上皮细胞凋亡与自噬中的作用,为镉的肾毒性机制研究提供重要的理论依据。首先,对镉诱导胞浆钙超载的来源进行了探究。在本实验中,用胞浆Ca2+特异性探针Fluo-4-AM,线粒体Ca2+特异性探针dihydro-Rhod-2-AM和内质网Ca2+特异性探针Mag-Fluo-4-AM分别检测胞浆、线粒体和内质网Ca2+水平。通过rPT细胞在含钙和无钙两种培养体系中进行不同时间的镉暴露,对胞浆钙浓度的变化进行检测。接着检测了镉暴露对胞浆、线粒体和内质网Ca2+水平的影响。随后镉与2-APB共孵育12 h,检测2-APB对镉诱导的胞内钙重分布的影响。最后采用放射免疫分析法和免疫印迹法分别检测镉染毒对IP_3含量和IP_3R(IP_3R-1与IP_3R-2)蛋白表达水平的影响。结果表明镉暴露导致胞内钙重分布,且IP_3-IP_3R通路激活导致的内质网钙库释放是胞浆钙超载的主要来源。其次,探讨了镉诱导的胞浆钙超载对细胞凋亡的调节作用。用TG、BAPTA-AM及2-APB对细胞进行处理,对胞浆钙超载与细胞凋亡的关系进行研究。首先通过Hoechst33258染色来观察细胞核凋亡的形态变化,同时用细胞流式技术对细胞凋亡率进行检测,最后通过CCK-8检测细胞存活率。结果表明镉诱导的胞浆钙超载可促进细胞凋亡,导致细胞毒性。再次,对镉诱导的胞浆钙超载与细胞自噬的关系展开研究。首先对LC3、p62的蛋白表达水平进行了检测,接着使用RFP-GFP-LC3与GFP-LC3对细胞进行转染,观察镉诱导的胞浆钙超载对自噬流以及自噬小体数量的影响。结果表明在镉处理的肾小管上皮细胞中,胞浆钙超载抑制自噬流并且阻碍自噬小体的降解。随后,采用免疫荧光技术对LC3与LAMP-1及LC3与Rab7的共定位情况进行检测,结果显示镉诱导的胞浆钙超载可阻碍自噬小体与溶酶体的融合,主要原因是Rab7对自噬小体的载运功能失效。最后,对氧化应激与自噬之间的联系展开了研究。首先用三种胞浆钙调控剂对胞浆钙超载与氧化应激之间的联系进行了检测。随后采用ROS清除剂NAC对细胞进行处理。先对LC3和P62蛋白表达量进行分析。再采用免疫荧光技术对LC3与LAMP1及LC3与Rab7进行共定位分析。结果表明在镉处理的大鼠肾小管上皮细胞中,胞浆钙超载促进氧化应激的产生,且氧化应激参与镉诱导的自噬流损伤。综上所述,镉暴露导致胞内钙重分布,即胞浆钙超载同时伴随线粒体钙超载与内质网钙外流;IP_3激活的IP_3R通路导致的内质网钙库释放是胞浆钙超载的主要来源。镉诱导的胞浆钙超载在促进细胞凋亡的同时抑制自噬流,提示我们胞浆钙超载在自噬和凋亡中的起到双重调节作用。升高的胞浆钙离子主要通过抑制Rab7对自噬小体的载运作用来抑制自噬小体与溶酶体的融合从而导致自噬流抑制,造成自噬小体的蓄积。镉诱导的胞浆钙超载可激活氧化应激,且氧化应激可诱导自噬流损伤。
[Abstract]:In this experiment , the effects of cadmium exposure on cell apoptosis and cell autophagy in rat renal tubular epithelial cells induced by cadmium were studied .
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R99

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