肝靶向糖基化纳米诊疗胶束的制备及体外研究

发布时间：2018-06-27 00:04

本文选题：乳糖 + 半乳糖　；参考：《广州医科大学》2017年硕士论文

【摘要】：研究目的1.本研究尝试制备一种新型含有乳糖或半乳糖的兼具MR诊断、抗肿瘤药物智能释放、肝脏主动靶向等多功能聚合物纳米诊疗胶束,PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox,并表征其理化性质。2.通过体外细胞实验,研究诊疗胶束细胞摄取机制,探讨其对肿瘤细胞(HepG2)的杀伤力,检测诊疗胶束对肝癌细胞的靶向性。通过体外MRI显像,证明所制备的胶束能够新型多功能影像对比剂。研究方法首先以十二醇为引发剂,通过己内酯(ε-CL)的开环聚合反应制备出疏水性聚合物:聚己内酯(PCL);然后经过两步化学反应将PCL的端羟基转化成含有二硫键链接的氨基(PCL-ss-NH2);后以PCL-ss-NH2为大分子引发剂,引发叠氮化谷氨酸酯环内酸酐(AELG-NCA)单体聚合成功制备出含二硫键的嵌段聚合物PCL-SS-PAELG;最后,通过“Click”反应,将炔基化乳糖Lactose、炔基化半乳糖Galactose偶联到所合成的共聚物,形成PCL_(37)-SS-PGluLac10和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)。所得糖基化聚合物具有两亲性行为,在水溶液中可通过自组装行为成纳米胶束。基于该类糖基化嵌段聚合物的两亲性行为,可通过透析法将疏水性超顺磁性氧化铁(SPIO)、抗肿瘤药物阿霉素(DOX)包载于其疏水内核中,制成肿瘤诊疗一体化纳米胶束PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox。通过~1HNMR和FTIR对PCL_(37)-SS-PGluLac10和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)进行表征;分别用动态光散射(DLS)及透射电镜(TEM)测定胶束的表面形貌、粒径及粒径分布;采用芘荧光法检测临界胶束浓度;通过含荧光染料标记的植物凝集素特异性识别实验检测诊疗胶束的生物活性;并对阿霉素及SPIO的包载率、诊疗胶束体外药物还原响应智能释放行为进行研究。用MTT法评价含糖基化药物胶束PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox以及PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox的肿瘤细胞杀伤力。选用的细胞为人肝癌细胞(HepG2)。设置由低到高六个浓度梯度值,在酶标仪上测得每孔的吸光度值(OD值)计算细胞存活率。通过Dox荧光观察、DAPI染核以及流式细胞术来分析细胞对诊疗胶束的摄取及分布情况。采用半乳糖抑制性实验检测含糖诊疗胶束的肝靶向性。通过体外MRI显像检测胶束的T2对比效果。研究结果1.~1HNMR和FTIR结果证实PCL_(37)-SS-PGluLac10和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)制备成功。DLS测得所制备的诊疗胶束PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox平均粒径为(120.8±1.7)nm,PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox平均粒径为(150.1±2.6)nm;TEM下观察所得到的胶束呈均一的球状结构。2.芘荧光法测得PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)的CMC值为0.0105 mg/mL,PCL_(37)-SS-PGluLac10的CMC值为0.0166 mg/mL。植物凝集素特异性结合实验表明糖聚肽可以特异性结合凝集素。Dox释放实验表明,在含有GSH的情况下,两种胶束都能快速释放药物,12h释放量分别达到了58.6%和70%;在24h Dox几乎完全释放。3.细胞毒性实验结果:空白未载药胶束PCL_(37)-SS-PGluLac10和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)与肝癌(HepG2)细胞共孵育48h后,MTT法测得的细胞生存率均维持在80%以上,而载药胶束PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox与肝癌(HepG2)细胞共孵育48h后发现:细胞生存率与药物浓度成反比关系,随着药物Dox浓度的提高,细胞生长抑制作用越显著。4.荧光观察、DAPI染核分析结果显示:两种糖基化纳米诊疗胶束均可以较快被细胞摄取并且主要进入细胞质内,Free Dox主要进入细胞核内。半乳糖竞争性抑制实验证明了含糖胶束对肝癌细胞的主动靶向性。5.体外MRI成像结果显示:随着Fe离子浓度的逐渐增加,PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox两种胶束MR T2WI信号逐渐减低;其对应T2弛豫率分别为:168.1 Fe mM-1·s-1、259.4 Fe mM-1s-1,明显优于Feridex?(111.5 Fe m M-1 s-1)。证明了其优良的T2对比效果。结论1.本研究成功制备了一种新型含有乳糖或半乳糖的兼具MR诊断、抗肿瘤药物智能释放、肝主动靶向性等多功能的两亲性聚合物纳米诊疗胶束,PCL_(37)-SS-PGluLac10@SPIO/Dox和PCL_(37)-SS-PGluGal_(10)@SPIO/Dox。2.制备的两种含糖诊疗胶束粒径小,大小均一,具有良好的水溶性、胶体稳定性、生物相容性、抗肿瘤效应以及MR显像等多种功能于一体,具有一定的潜在应用前景。
[Abstract]:A novel multifunctional image contrast agent ( PCL _ ( 37 ) - SS - PGluten @ SPIO / Dox and PCL _ ( 37 ) - SS - PGluGal 10 @ SPIO / Dox and PCL _ ( 37 ) - SS - PGlutar10@SPIO / Dox and PCL _ ( 37 ) - SS - PGluGal _ ( 10 ) were prepared .
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R943

【参考文献】