新型雷莫拉宁衍生物的制备及其卤化酶基因的初步研究

发布时间：2018-07-25 17:42

【摘要】：随着万古霉素耐药性的发生和发展,处于Ⅲ期临床研究的雷莫拉宁是一个具有良好前景的抗耐药菌候选药物。通过对雷莫拉宁的结构修饰,获得更好抗菌活性雷莫拉宁类似物是非常有诱惑力,然而实验室保存的三株雷莫拉宁基因工程菌株,它们的发酵产量非常低,阻碍了后续的研究。本论文首先对三株基因工程菌种复壮、自然选育,经过初筛复筛最终获得:发酵效价为489μg/mL的产无糖雷莫拉宁菌株SIPI-A.dorf29-2016、发酵效价为368μg/mL的产无氯雷莫拉宁菌株SIPI-A.dorf20-2016和发酵效价为476μg/mL产无氯无糖雷莫拉宁菌株SIPI-A.dorf20-dorf29-2016。三者均比其出发菌株发酵效价有了不同程度的提高。通过考察单因素,组合因素实验对发酵培养基与发酵条件的一系列优化,最终发酵单位比现有的发酵水平总体再次提高了2倍。通过对无糖雷莫拉宁发酵液的前处理条件的摸索,建立了成熟的初提方法。随后对大孔吸附树脂NM100,SP825的分离能力的考察及对色素去除的研究,摸索出来获得无糖雷莫拉宁粗品分离工艺。此工艺可以很好地去除色素,富集纯度大于90%的无糖雷莫拉宁。在此基础上经中低压制备条件与高压半制备条件的优化,探索出来一条获得无糖雷莫拉宁精制的分离工艺。整个分离工艺的总收率在55%左右。此工艺可以获得液相纯度大于98%无糖雷莫拉宁。整个工艺适用于无氯雷莫拉宁与无氯无糖雷莫拉宁的分离与纯化。抗菌活性检测的结果显示,三种雷莫拉宁类似物与其本身的抑菌活性相当,并无差别。氯原子的缺失对活性没有造成影响。为了进一步理解雷莫拉宁的生物合成机制,在大肠杆菌中异源表达了雷莫拉宁的卤化酶,通过对诱导条件的优化,发现在TransB(DE3)宿主加入膜增溶剂苯甲醇诱导表达后,可以获得可溶性蛋白。生物信息学研究表明卤化酶的催化过程需要FADH2的参与,因此构建了FAD还原酶E.coliBL21-Fre菌株,经诱导条件优化后,可以获得大量可溶性蛋白,测得粗酶液的酶活为3U/ml。为探索获得多样性氯化的新的杂合糖肽类抗生素奠定了基础。
[Abstract]:With the occurrence and development of vancomycin resistance, Ramolanine, which is in stage 鈪，

本文编号：2144557