长效HIV融合抑制剂的设计、评价及其作用机制研究

发布时间：2018-11-13 08:32

【摘要】：多肽类HIV融合抑制剂——T20(药品通用名：恩夫韦肽)已用于临床治疗艾滋病,但由于该多肽药物半衰期短、药效低、生产成本高,从而限制了其临床应用。近年来,一系列更高效率的多肽类HIV融合抑制剂,如T1144,被开发出来,然而其半衰期相对较短和生产成本高的缺点仍然是制约多肽HIV融合抑制剂药物发展的瓶颈。如何设计长效且生产成本比多肽药物低的非多肽HIV融合抑制剂成为未来HIV融合抑制剂研发领域的关键科学问题。本研究设计出一个长效的蛋白类HIV融合抑制剂一一FLT (FN3-L35-T1144)。FLT是由三个蛋白片段(或多肽)组成,即FN3、L35和T1144。FN3为具有独特结构的拟抗体,其分子量小,可以与人血清白蛋白(Human Serum Albumin)发生可逆性结合,从而达到延长体内半衰期的作用。T1144为第三代多肽类HIV融合抑制剂,具有比T20更高效的抗HIV-1病毒活性。L35是由35个氨基酸构成的连接肽,它把FN3和T1144连接在一起形成一个新的蛋白类HIV融合抑制剂——FLT (FN3-L35-T1144)。我们的试验结果证明FLT具有高效、广谱的抗HIV-1活性,在体内的半衰期明显延长。此外,FLT重组蛋白可以在大肠杆菌(原核系统)中大量可溶性地表达,大大降低了HIV融合抑制剂药物生产成本。因此,使用拟抗体技术可显著延长HIV融合抑制剂的半衰期,降低药物的生产及治疗成本,为解决多肽药物的开发瓶颈提供新的解决方法。本研究主要围绕HIV融合抑制剂的长效性研究展开,主要结论如下：以pPBHFT-Fn3-FG和PGEX-6P-1MD1.1-L35-T1144质粒为模板,成功构建了重组蛋白FLT。目的蛋白在原核表达系统中可获得大量表达(绝大部分以上清表达为主,不溶的包涵体形式很少)。通过连接拟抗体FN3结构域,可以促进高度疏水序列T1144的原核表达产量。拟抗体FN3结构域利用其自身的高表达性,作为分子伴侣促进了T1144的折叠。每升大肠杆菌中,约可获得重组蛋白20 mg以上,成功解决了含多疏水性氨基酸序列蛋白的表达问题。本实验通过基因重组技术将不同功能的多肽连接,同时设计了一段富含亲水性的氨基酸的小分子多肽连接序列—-L35 (G-G-G-G-S)7作为柔性序列,最大程度上解决空间位阻问题,从而得到具有双功能的重组蛋白FLT。在HIV-1 ⅢB和Bal病毒抑制实验中,FLT均在低纳摩尔级表现出病毒抑制能力,其IC50值分别为11.39 nM和14.90 nM。重组蛋白FLT对临床病毒株同样表现出很强的病毒抑制能力。HIV-1融合抑制剂的主要作用机制是抑制病毒与靶细胞膜的融合,而HIV-1表面膜蛋白gp41六螺旋核心束的形成是gp41介导膜融合过程中的关键步骤。通过六螺旋竞争实验和荧光非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(FN-PAGE)实验,发现重组蛋白FLT发挥高效抗病毒作用的机制是干扰gp41的NHR和CHR形成六螺旋核心束。采用等温滴定量热技术(ITC)和表面等离子共振技术(SPR)检测重组蛋白FLT在体外与人血清白蛋白的结合情况,得到重组蛋白FLT与人血清白蛋白的结合常数Ka为2.50×106,结合比为2.711。本实验采用双抗夹心ELISA法对FLT重组蛋白、T1144多肽及T20多肽进行定量检测。药物代谢动力学研究表明,单次尾静脉注射FLT蛋白后血清药物浓度消除呈非线性消除。T20多肽的半衰期约为1.22±0.2 h,T1144多肽的半衰期约为7.48±0.4 h,FLT重组蛋白的半衰期可达27.10±6.9 h,达到T20多肽半衰期的22.19倍,T1144多肽半衰期的3.62倍。注射FLT蛋白、T1144多肽和T20多肽后,不同时间点的血清样本对HIV-1病毒抑制效果呈现出与体内药物浓度相同趋势变化。同时,本实验对下一代双功能HIV融合抑制剂2DLT与抗艾滋病药物的协同作用进行研究,证实2DLT可以与抗逆转录病毒药物组合使用具有互补和协同效应,表明2DLT可进一步开发成一个新的蛋白类抗HIV药物,可与其他抗HIV药物联用来治疗那些已对现有的抗逆转录病毒药物产生高度耐受性的艾滋病人。
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【学位授予单位】：复旦大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R91

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