二甲基甲酰胺对心肌细胞L-型钙电流影响的实验研究

发布时间：2018-11-17 20:25

【摘要】：目的二甲基甲酰胺（DMF）是一种应用极其广泛的万能有机溶剂，在各个制造行业大量使用，其对职业接触人群健康影响也越来越大。目前研究较为深入的是DMF对肝脏的损伤而其对心脏损害的研究十分罕见，，仅见于少量临床病例报告中。课题组在前期的现场卫生学调查中发现DMF职业接触者有明显的心电图异常和心律不齐表现，动物染毒实验中也发现DMF会致使心肌细胞发生病变坏死及产生脂质过氧化等改变。为了研究DMF对心肌产生损害的机制，本实验采用了全细胞膜片钳技术记录不同剂量的DMF作用后H9C2心肌细胞的L-型钙电流通路变化，研究DMF对心肌细胞造成的电生理改变，初步探讨DMF对心肌的毒性作用机制。材料和方法实验用心肌细胞系购于中科院上海细胞库，为正常大鼠心肌细胞系（H9C2），实验室培养细胞处于对数生长期时，消化并置于玻片上（细胞密度约为l105/ml），待2h后细胞完全贴壁加入含有10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，在5％CO2、37oC培养箱中培养24h。培养24h后用含有不同剂量DMF的新鲜培养液再次培养心肌细胞24h，用PBS缓冲液清洗三次后置于细胞外液中用于膜片钳实验。保持实验环境在25oC左右，镜下选择贴壁良好、边缘清晰、折光性良好的单个细胞进行实验。微电极采用两步法拉制而成，充灌电极内液后阻值在2-5M。微电极经电极夹持器与注射器相连，给正压后浸入电极外液接触心肌细胞，使用注射器给予负压形成高阻封接，继续施加负压吸破细胞膜，形成全细胞记录模式。在电压钳模式下，记录低剂量组（140mM DMF染毒组）、高剂量组（220mMDMF染毒组）的L-型钙电流的变化，并与正常心肌细胞对照组进行比较。钙电流的记录和刺激程序均由PatchMaster软件完成，输出信号经HEKA EPC10USB放大器放大。记录的信号经放大保存后，用配套的FitMaster分析软件进行处理，再经相应分析模块得出相应的图形和数据。组间比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义，数据处理使用SPSS13.0统计软件完成。结果经过具体分析后发现三个实验组的I-V曲线均在+20mV左右达到峰值，心肌细胞的L-型钙电流的I-V曲线的形状并没有明显改变，表明钙电流的电压依赖性没有改变，但是随着DMF的作用剂量增大，I-V曲线不断上移，心肌细胞L-型钙电流不断减小。峰值电流密度比较显示：对照组的平均峰值电流密度为-9.50±0.44pA/pF（n=10），低剂量组（140mM DMF）的平均峰值电流密度为-4.43±0.46pA/pF（n=10），峰值电流密度下降了53.37%，差异有统计学意义（P＜0.01）。高剂量组（220mM DMF）的平均峰值电流密度为-2.37±0.23pA/pF（n=10），相比较于对照组下降了75.05%，差异有统计学意义（P＜0.01）。高剂量组（220mMDMF）的平均峰值电流密度较低剂量组（140mM DMF）的平均峰值电流密度下降了46.50%，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论DMF干预后，H9C2心肌细胞发生了一系列的电生理学方面的变化，L-型钙电流峰值平均电流密度随着DMF作用剂量的增加而降低呈现明显的剂量依赖关系，并提示DMF引起的心电图异常和心律不齐等改变可能与其以电压依赖方式抑制了心肌细胞膜上的L-型钙离子通道电流，使钙离子内流减少有关。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【参考文献】