二苯乙烯苷顺反异构体的降血脂作用、药动学与组织分布对比研究

发布时间：2018-12-15 02:54

【摘要】：二苯乙烯苷（2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，简称THSG）为中药何首乌中的主要水溶性成分，具有抗氧化、降血脂、抑制骨质疏松、抑制血管内皮细胞过度增生、神经保护、心肌保护、改善动脉硬化及加速血流等诸多药理作用。有研究表明何首乌中除含有反式二苯乙烯苷（trans-THSG）外，还含有一定量的顺式二苯乙烯苷（cis-THSG）。因trans-THSG较顺式结构稳定，所以在自然条件下THSG主要以反式结构存在，且以往的研究都是以trans-THSG为主，而对cis-THSG的研究较少。本研究首次制备了cis-THSG纯品，并经四大光谱进行鉴定；测定了cis-THSG相对于trans-THSG的校正因子，为今后cis-THSG的含量测定奠定了基础。在以上研究基础上，本实验对THSG顺反异构体的降血脂作用进行对比研究，并建立了HPLC法同时测定小鼠血浆及各组织中THSG顺反异构体的含量，对二者药动学及组织分布差异进行对比研究，为今后进一步开发THSG类降血脂药物奠定了理论基础。第一部分顺式二苯乙烯苷的制备及结构鉴定目的：建立由trans-THSG制备cis-THSG的方法，并对所制备的cis-THSG进行结构鉴定。方法：通过对光照种类（日光、254nm紫外光和365nm紫外光）、溶剂（水和甲醇）、初始溶液浓度（0.1、0.2、0.4、0.8、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg/mL）及光照时间（5、10、15、20、25、30min）进行考察，确定由trans-THSG转化为cis-THSG的最佳条件。采用制备液相色谱法从转化后的溶液中分离纯化cis-THSG。在Diamonsil C18色谱柱上（250mm×10.0mm,5μm），以甲醇-水为流动相进行梯度洗脱，检测波长285nm，流速1.0mL/min，柱温30℃。收集cis-THSG流分经50℃减压蒸馏，剩余物用水溶解后冷冻干燥得白色固体粉末。采用质谱扫描、核磁共振、紫外光谱扫描及红外光谱扫描四大光谱对所得白色固体粉末进行结构鉴定。结果：最佳转化条件为trans-THSG用水溶解成浓度为6.0mg/mL的溶液，在365nm紫外灯下照射20min，过滤后直接注入液相色谱仪进行分离。质谱扫描显示白色粉末与trans-THSG具有相同的准分子离子m/z405.1[M-H]-，表明二者具有相同的分子量。对准分子离子m/z405.1[M-H]-进行二级质谱扫描，得到相同的丢失一个糖基的碎片离子m/z243.1[M-C-6H11O5]及其他相同的碎片离子，如m/z225.1、173.0、145.2、137.1和109.0，，表明二者具有相同的裂解规律。在1H-NMR图上有顺式双键质子信号。紫外全扫描图谱结果显示其最大吸收波长由trans-THSG的320nm紫移至285nm处。红外光谱显示3500-3200(νO-H)、2924和2885(νC-H)、1609和1514(νC-C)、1456(δC-H)、690(γ-1=C-H) cm处有吸收峰，其中690cm-1为顺式烯烃面外振动的标志。由四大光谱结果证实制备所得白色粉末即为cis-THSG。结论：该方法简便快捷，制备效率高，适用于由trans-THSG制备cis-THSG。第二部分基于液相色谱的顺式二苯乙烯苷相对于反式二苯乙烯苷的校正因子的测定目的：测定cis-THSG相对于trans-THSG的校正因子。方法：采用C18色谱柱，以乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸（11:7:82）为流动相，流速1.0mL/min，cis-THSG的检测波长为285nm，trans-THSG的检测波长为320nm，柱温30℃，进样量20μL。分别配制系列浓度的cis-THSG和trans-THSG标准溶液，注入液相色谱仪进行测定。以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，进行线性回归，求得两物质的回归方程，由cis-THSG回归方程的斜率与trans-THSG的相比得出相对校正因子。将trans-THSG的各峰面积经相对校正因子校正后与trans-THSG的浓度进行线性回归，得出一条校正后的回归方程，作为cis-THSG的校正方程。分别采用对照品和供试品对相对校正因子进行评价。对照品评价是将cis-THSG各浓度标准溶液峰面积代入校正方程，求得浓度与真实浓度相比计算回收率。供试品评价则是利用所得相对校正因子计算供试品中cis-THSG的浓度并与外标法实测值进行比较，计算相对回收率。结果：cis-THSG的回归方程为Y=33.54X+1.190（R2=0.9997），trans-THSG的回归方程为Y=43.48X-0.5007（R2=0.9991），且二者分别在0.112～112μg/mL和0.110～110μg/mL范围内与峰面积线性关系良好，两回归方程斜率相比求得相对校正因子f=0.771。方法学验证结果显示cis-THSG和trans-THSG的仪器精密度RSD分别为0.92%和1.07%，日内精密度RSD分别为1.22%和3.81%，日间精密度RSD分别为3.40%和2.63%。回收率范围为96.2～101.3%，RSD值在1.19～4.89%，对照品评价回收率均在95.4～102.6%范围内，而供试品评价相对回收率均在100.1～102.7%范围内。结论：所得的cis-THSG相对于trans-THSG的校正因子可用于cis-THSG的体外含量测定，解决了cis-THSG没有市售对照品的困难。第三部分二苯乙烯苷顺反异构体的降血脂作用对比研究目的：对比研究cis-THSG和trans-THSG的降血脂作用。方法：以小鼠血清中总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平作为衡量血脂高低的指标。考察高、低两种剂量的cis-THSG和trans-THSG对正常小鼠血脂的影响；以食糜性慢性高血脂小鼠为模型，给予高脂饲料的同时给予cis-THSG和trans-THSG，连续15天后观察高、低剂量两种药物对小鼠血脂的影响；小鼠腹腔注射Triton试剂所致急性高血脂小鼠为模型，分别考察高、低两种剂量的cis-THSG和trans-THSG对模型小鼠血脂的影响。结果：对正常小鼠，cis-THSG和trans-THSG对血清中TC和TG都无显著影响，但都能极显著性的降低LDL-C的水平。另外，高剂量对HDL-C的水平都有显著性升高的作用。对食糜性慢性高血脂小鼠，cis-THSG对TC和TG都具有显著性降低作用；而trans-THSG仅低剂量对TG有显著性降低的作用，高剂量对TC、TG均无显著性影响。对腹腔注射Triton所致急性高血脂小鼠，除低剂量cis-THSG对高血脂小鼠血浆中HDL-C的影响不明显外，cis-THSG和trans-THSG均能较显著性降低TC、TG、HDL-C及LDL-C的水平。结论：cis-THSG对正常小鼠和急性高血脂小鼠的降血脂作用与trans-THSG基本相同，但对慢性高血脂小鼠血浆中TC和TG的降低作用明显强于trans-THSG。说明cis-THSG具有比trans-THSG更好的降血脂作用。第四部分二苯乙烯苷顺反异构体在小鼠体内的药动学对比研究目的：建立HPLC法同时测定小鼠血浆中cis-THSG和trans-THSG的浓度，并对其进行药动学对比研究。方法：分别采用尾静脉注射和灌胃的方式给予小鼠cis-THSG和trans-THSG（尾静脉注射均按20mg/kg给药计，灌胃给药均按50mg/kg给药计）的混合液，于5、10、20、30、40、50、60、90、120、150和180min摘眼球取血，置肝素化的离心管中以4743×g离心5min后取血浆。采用Diamonsil C18色谱柱（250mm×4.6mm,5μm），乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸（11:7:82）为流动相，流速1.0mL/min，cis-THSG的检测波长为285nm，trans-THSG和虎杖苷的检测波长为320nm，柱温30℃，进样量20μL。以虎杖苷为内标物，取血浆样品200μL，加入20μL内标溶液，再用600μL的甲醇沉淀蛋白，涡旋10s后以16600×g离心10min。精密量取上清液700μL，在40℃氮气流下吹干，加流动相200μL，涡旋使剩余物全部溶解，离心10min后进行测定。采用药-时曲线上最后4个数据经对数变换后进行线性回归计算消除速率常数(k)，采用梯度积分法计算得AUC0-t和AUC0-∞。结果：血浆中cis-THSG在0.228～182μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.0261X-0.0060（R2=0.9986），trans-THSG在0.245～196μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.0338X-0.0073（R2=0.9968）。通过对低、中、高及定量下限4种浓度的QC样品进行考察得日内、日间精密度RSD均小于8.30%，准确度RE均在-9.69%～4.08%范围内。对血浆样品的3次冻融循环后的稳定性、室温下（25℃）放置4h的短期稳定性、-20℃冷冻条件下保存15天的长期稳定性和样品处理后再室温下置于自动进样器中12h的稳定性进行考察，其RE均在-6.59%～1.33%之间。iv给予cis-THSG和trans-THSG的AUC0-t分别为2188.80和756.43μg·min/mL，AUC0-∞分别为2244.29和785.51μg·min/mL，半衰期分别为163.61和82.13min；ig给予cis-THSG和trans-THSG的AUC0-t分别为3759.49和823.48μg·min/mL，AUC0-∞分别为3807.42和846.71μg·min/mL，半衰期分别为140.84和65.58min，Cmax分别为115.15和53.92μg/mL，Tmax分别为30和20min。结论：该方法专属性好，灵敏度高，简便快捷，适用于小鼠血浆中cis-THSG和trans-THSG含量的测定。结果表明二者药动学存在较大的差异，cis-THSG的半衰期比trans-THSG长，生物利用度比trans-THSG高。第五部分二苯乙烯苷顺反异构体在小鼠体内的组织分布对比研究目的：建立同时测定小鼠各组织中cis-THSG和trans-THSG浓度的方法，并对其组织分布特征进行对比研究。方法：采用尾静脉注射和灌胃的两种方式给予小鼠cis-THSG和trans-THSG（尾静脉注射均按20mg/kg给药计，灌胃给药均按50mg/kg给药计）的混合液，于5、20和50min处死并立即取心、肝、脾、肺、肾、胃、肠、脑及膀胱，各组织用重蒸水洗净，滤纸吸干后称重剪碎，以1:2（w/v）比例加入生理盐水后进行匀浆。以虎杖苷作为内标，取组织匀浆样品200μL，按与第四部分样品处理方法及色谱条件进行测定。以肝组织为代表对其方法学进行考察。结果：组织匀浆中cis-THSG在0.228～182μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.0263X-0.0173（R2=0.9963），trans-THSG在0.245～196μg/mL范围内线性关系良好，回归方程为Y=0.0334X-0.0034（R2=0.9994）。通过对低、中、高3种浓度的QC样品及定量下限样品进行考察得日内、日间精密度RSD均小于9.47%，准确度RE均在-6.81%～4.18%范围内。对组织样品的3次冻融循环后的稳定性、室温下（25℃）放置4h的短期稳定性、-20℃冷冻条件下保存15天的长期稳定性和样品处理后再室温下置于自动进样器中12h的稳定性进行考察，其RE均在-9.49%～-0.88%之间。结果显示二者能广泛分布在除脑组织外的各组织中，但分布规律各有特点，且在相同的给药剂量下trans-THSG在各组织中的含量远远高于cis-THSG。结论：所建HPLC法简便快捷，专属性好，灵敏度高，可用于小鼠体内cis-THSG和trans-THSG的组织分布研究。THSG的顺反异构体在体内的分布有差异，预示二者可能具有不同的药理作用及毒副作用。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

【引证文献】