蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的发酵优化、结构鉴定及生物活性研究

发布时间：2018-12-19 07:36

【摘要】：蝙蝠蛾拟青霉(Paecilomyces hepiali)是天然冬虫夏草中一种重要的内生真菌,由于其人工培养物的化学组成与天然冬虫夏草具有高度的相似性,使得该菌已成为人工虫草制品发酵生产的重要无性型菌株。多年来,天然冬虫夏草和人工虫草中多糖类组分的结构和生物活性研究一直深受关注,但大部分研究均基于天然虫草或人工虫草菌丝体多糖,而对其液体培养过程中释放到发酵液中的多糖组分一胞外多糖(Exopolysaccharide)研究较少。相对于菌丝体中胞内多糖,胞外多糖具有产量高、易分离和结构可调控等优点,可作为多糖资源开发的重要来源。为此,本课题对蝙蝠蛾拟青霉高产胞外多糖液体发酵条件进行优化,并对所获得的胞外多糖进行了分离纯化和结构鉴定,进一步研究了该胞外多糖在肠道菌群调节、机体免疫调节和小鼠酒精肝损伤的保护等方面的生物活性。主要研究结果如下：1.蝙蝠蛾拟青霉高产胞外多糖发酵条件优化通过单因素实验对影响蝙蝠蛾拟青霉菌丝体生物量和胞外多糖产量的碳氮源、无机盐和维生素种类进行比较,结果得出蔗糖、酵母膏、(NH4)2SO4、KH2PO4、 MgSO4·7H2O、CaCl2-2H2O、土豆汁和麦芽汁等8种营养因子对菌丝体生长和胞外多糖产生有较好的促进作用。在此基础上,采用部分因子设计(FFD)对其中的显著性影响因素进行了筛选,结果表明蔗糖、酵母膏、NH4)2SO4和KH2PO44种营养因子浓度可以显著影响菌丝体生物量和胞外多糖综合收益D-值。为获得最高的综合收益D-值,采用中心组合(CCD)对这四种营养因子最佳浓度进一步优化,得到了蝙蝠蛾拟青霉液体发酵同时高产菌丝体和胞外多糖的最佳培养基为：蔗糖46.08g/L,酵母膏4.71 g/L,(NH4)2SO45.72 g/L,KH2PO41.70 g/L,CaCl20.50 g/L, MgSO40.50 g/L,土豆汁1%(v/v)和麦芽汁1%(v/v)。在此条件下,菌丝体生物量和胞外多糖产量分别可达12.98士0.14 g/L和5.33土0.11 g/L。2.蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖的组成、纯化、理化性质和结构解析比较了不同碳源对蝙蝠蛾拟青霉液体发酵菌丝体产量和胞外多糖产量的影响,结果表明碳源除了对它们的产量有显著影响外,还可以影响多糖片段的理化特性如分子量、单糖组成、糖醛酸含量和蛋白含量等,其中以葡萄糖和甘露糖为碳源可以增加高分子量胞外多糖的比例,而以乳糖为碳源则不能增加多糖中半乳糖的比例。对以蔗糖为碳源发酵所获得的胞外多糖,首先通过膜分离获得了截留分子量在10kD-1000kD之间组分,然后分别通过DEAE-纤维素阴离子交换层析和Sephdex-G 100凝胶柱层析进行分离得到了PHP-1,PHP-2和PHP-3三个纯化组分,分子量分别为1.78×105,2.32×105,1.19×105Da,单糖的摩尔组成分别为：PHP-1 (Man:Rib:Rha: Glc:Gal:Ara=53.62:3.20:3.51:13.10:14.17:2.24),PHP-2 (Man:Rib:Rha:GlcUA:GalUA: Glc:Gal:Ara=55.26:3.05:2.85:0.73:0.58:14.08:15.52:4.47), PHP-3 (Man:Rib:Rha:GlcUA: GalUA:Glc:Gal:Xyl:Ara=25.60:3.78:7.30:6.75:4.43:13.76:30.05:1.35:7.84);通过多种分析方法对3种多糖组分的化学组成进行了测定,结果表明3种多糖分别具有不同的中性糖、糖醛酸、硫酸基及磷酸基含量；经红外光谱、甲基化和核磁分析表明3种多糖的主链由→2,6)-a-D-Manp-(1→的甘露聚糖组成,侧链出现在→6)-α-D-Manp-(1→的O-2位置,由→2-α-D-Manp-(1→和非还原性末端的α-D-Manp、(β-D-Galp组成。3.蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖对肠道菌群的调节作用研究通过体外模拟研究了蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖在肠胃液消化过程中的稳定性,结果表明3种胞外多糖在人工胃液和肠液中具有良好的稳定性；进一步通过体外人粪样发酵模型研究了3种胞外多糖在体外发酵体系中的代谢转变及对发酵体系中微生物菌群的影响,结果表明添加胞外多糖的发酵体系中,不同菌群能够较好的实现菌群间的更替转变,特别是益生菌双歧杆菌(Bifidobacterium spp.)能够较好地增殖,对乳酸菌(LactobacilluslEnterococcus spp.)的生长也有较好的促进作用,虽然拟杆菌(Bacteroides-Prevotella spp.)和梭状菌(Clostridium coccoides-Eubacterium rectale group)数量在发酵初期也有显著增加,但在发酵后期可以受到抑制；采用HPLC法对发酵进程中胞外多糖的代谢以及短链脂肪酸和乳酸的产生情况进行了监测,结果显示多糖在发酵24 h时绝大部分可被水解,同时短链脂肪酸产量显著增加,且乙酸与丙酸、丁酸的比例显著降低,表明该胞外多糖也可以有效调节不同短链脂肪酸的产生量。4.蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PHP-3的免疫调节作用研究采用体外细胞实验研究了蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PHP-3组分对脾细胞的增殖作用和对巨噬细胞激活后相关细胞因子释放量的影响。结果表明PHP-3多糖组分能有效促进小鼠脾淋巴细胞增殖,且与ConA具有一定的协同作用；与巨噬细胞的相互作用研究表明PHP-3多糖组分能有效提高巨噬细胞吞噬中性红的能力,并增加巨噬细胞免疫效应分子NO和细胞因子TNF-α、IL-1β的释放量,显示PHP-3组分在体外具有较好的免疫促进功能；采用环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠模型试验了PHP-3多糖组分的体内免疫促进活性。结果显示灌胃中、高剂量的PHP-3多糖组分能够有效拮抗环磷酰胺引起的小鼠脾脏指数下降,进一步的血清学检测表明灌胃PHP-3多糖组分可显著提高免疫抑制小鼠血清溶菌酶活性、溶血素水平以及TNF-α、IL-1β的释放量,显示了蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PHP-3多糖组分对免疫抑制小鼠非特异性免疫和特异性免疫能力的促进作用。5.蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PHP-1对小鼠酒精肝损伤的保护作用研究采用小鼠酒精肝损伤模型评价了蝙蝠蛾拟青霉胞外多糖PHP-1组分对酒精肝损伤小鼠的保护作用。结果表明,在灌胃酒精前2h提前灌胃PHP-1多糖溶液对酒精造成的肝损伤有一定的保护作用,主要表现为PHP-1中、高剂量实验组小鼠血清中AST、 ALT活性、TC含量和小鼠肝脏中MDA水平、TC含量的显著降低,同时小鼠肝脏中SOD、 GHS-Px、CAT三种抗氧化酶活力显著提高；肝脏外部和病理形态观察也显示出小鼠肝细胞内脂肪堆积减少、细胞水肿和组织浸染水平的减轻。
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【学位授予单位】：南京农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：Q936;R915
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本文编号：2386613