高通量筛选发现结构多样性的Nampt活性化合物

发布时间：2019-02-25 20:56

【摘要】：烟酰胺磷酸核糖转移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase, Nampt),是一个具有多种生物学功能的蛋白,与肿瘤、糖尿病、脑卒中等疾病相关。Nampt最重要的功能是催化哺乳动物体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide, NAD)的生物合成,控制和调节细胞及线粒体内的NAD总量。NAD是生物体内多种氧化还原反应的辅酶,作为质子的传递者,参与细胞的能量代谢,NAD的生物能量状态甚至决定了细胞的生死存亡。因此,Nampt作为NAD代谢通路中的限速酶,已成为各种相关疾病的药物发现的重要靶标。本课题组前期研究证明,Nampt具有内源性神经保护作用,可作为脑卒中防治新靶标,开发Nampt激活剂将成为非常有前景的抗脑卒中新药。与此同时,在抗肿瘤药物的研发过程中发现,肿瘤细胞的Nampt酶活性升高,对Nampt抑制剂更为敏感,Nampt抑制剂通过抑制Nampt酶活性使得NAD耗竭,最终导致肿瘤细胞的死亡。目前,已进入临床试验阶段的Nampt抑制剂由于生物利用度低、剂量限制性毒性等原因,未能观察到较好的抗肿瘤疗效。因此,为了发现首个Nampt激活剂,填补这一领域的空白；也为了发现更多疗效好、结构类型多样的Nampt抑制剂,我们利用课题组前期建立的高通量筛选平台,对大样本量的化合物库开展了以Nampt为靶标的筛选工作。此外,有研究报道,尽管缺少分泌所必须的信号序列,Nampt仍可以被肝细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞等多种细胞分泌到细胞外,而对于Nampt在细胞外环境中是如何发挥其作用的一直存在很多争议。为了进一步探究Nampt是否具有细胞外酶活性,我们利用筛选平台检测方法,对血浆等生物样品中Nampt进行了检测。首先,我们对来自国家小分子化合物资源中心和Chemdiv化合物库总计39234个化合物(492块样品板)在20μM浓度下进行初筛,选出酶相对活性在40%以下的化合物347个,酶相对活性在125%以上的化合物2042个。其次,在20μM浓度下,设置化合物对照组,对初筛选出的2389个化合物进行复筛,以排除假阳性结果。经复筛确认后,选出695个Nampt活性化合物。再次,我们对其中的286个抑制型化合物,在2μM、0.2μM、0.02μM浓度下测定酶的相对活性,选出在2μM浓度下酶相对活性在50%以下并且有量效关系的化合物65个,分别测定了这65个化合物对离体酶活性抑制50%的浓度,即IC50值,选到IC50值在100nM以下的化合物8个,它们分别是4、22、23、24、36、39、44、60号化合物,它们的IC50值分别为59.41nM、85.52nM、70.94nM、75.86nM、62.65nM、86.92nM、85.05nM、60.85nM。筛选实验中的三个质控参数—Z'因子、变异系数、信噪比均符合高通量筛选的要求。为了进一步确认化合物的功能,我们考察了以上8个化合物在人肝癌细胞株HepG2上的细胞活性。设置化合物浓度为2μM,分别孵育HepG2肝癌细胞48小时,CCK8法进行细胞活力测定。结果显示,44号化合物对细胞增殖有明显抑制作用,抑制率为46%；之后,我们又进一步测定其对HepG2肝癌细胞抑制活性的IC50值为1.73±0.29μM,说明该Nampt抑制剂具有较强抗肿瘤活性。此化合物是通过抑制Nampt的酶活性,导致HepG2细胞内NAD耗竭,从而产生抗肿瘤活性。为了进行活性化合物的构效关系分析,为先导化合物的结构优化提供指导,我们在Chemdiv化合物库中分别寻找了先前发现的IC50小于2μM的47个活性化合物的结构类似物,总计455个,通过再次复筛的方法确认这些结构类似物的活性。结果显示,绝大多数结构类似物无活性,或活性较差(IC5020μM);少数(12个)结构类似物的离体酶活性IC50值虽然在2μM-20μM之间,但活性不如先前发现的47个活性化合物。这些重复测定进一步支持高通量筛选的可靠性。此外,为了确认Nampt是否具有细胞外酶活性,我们利用筛选中酶活性的检测方法对血浆等生物样品中的Nampt相关的分子进行检测。我们检测了正常小鼠血浆中Nampt的直接催化产物—烟酰胺单核苷酸(nicotinamide mononucleotide, NMN)是否存在,根据标准曲线测得NMN的浓度为120±22.4nM；我们考察了ATP浓度对Nampt酶活性的影响,测得ATP浓度从10nM-107nM范围内酶活性的相对高低,结果显示,在ATP浓度仅有10nM的条件下,Nampt仍具有较低的酶活性；我们制备了小鼠的大脑中动脉阻塞(MCAO)模型以检测病理状态下血浆ATP和Nampt水平,结果显示,与假手术相比,MCAO模型组小鼠血浆ATP和Nampt酶水平都显著升高。以上实验说明,Nampt在细胞外环境中具有烟酰胺磷酸核糖转移酶活性。本课题首次采用高通量筛选的方法对大型化合物库开展以Nampt为靶标的筛选工作,通过离体酶活性水平的通量化筛选发现了多种新型结构的Nampt抑制剂,有8个抑制活性较好,其中44号化合物在细胞水平也表现出较好的活性,并通过初步的结构类似物活性分析,为后续研究这些小分子化合物与Nampt的分子作用模式奠定基础。另外,我们利用筛选平台的检测方法,对血浆等生物样品中Nampt的酶活性进行了检测,确认Nampt具有细胞外活性,为后续的临床样本检测及作用机制研究奠定基础。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96;R914

【相似文献】