血管紧张素Ⅱ2型受体在实验性关节炎的作用及部分机制

发布时间：2019-04-10 18:37

【摘要】：血管紧张素Ⅱ是血管紧张素原在肾素和血管紧张素转化酶(angiotensin converting enzyme, ACE)的作用下或者通过糜蛋白酶等非ACE途径形成的八肽化合物。血管紧张素Ⅱ的受体包括1型受体(angiotensin II type1receptor, AT1R)和2型受体(angiotensin II type2receptor, AT2R),二者与血管紧张素Ⅱ的亲和力相似。血管紧张素Ⅱ通过AT1R在循环系统内发挥着收缩血管、调节血压和水钠平衡等作用。在高血压、充血性心力衰竭等心血管疾病治疗中广泛使用的血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensin converting enzyme inhibitors, ACEIs)和1型受体阻断剂(angiotensin II type1receptor blockers, ARBs)就是分别通过限制血管紧张素Ⅱ的产生或者阻断血管紧张素Ⅱ与AT1R受体的结合来发挥治疗效应。单核/巨噬细胞、树突状细胞和T淋巴细胞等炎症免疫细胞均拥有独立的肾素-血管紧张素系统。血管紧张素Ⅱ以自分泌或旁分泌的形式与炎症免疫细胞上的AT1R作用,通过刺激单核细胞趋化移行、诱导树突状细胞分化成熟、促进T淋巴细胞活化增殖、增强Thl和Th17免疫功能,进而参与炎症免疫反应。血管紧张素Ⅱ在类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)等自身免疫病的致病机制中发挥重要作用,ACEIs和ARBs分别通过阻断血管紧张素Ⅱ的产生和其与受体的相互作用,进而缓解RA等自身免疫病患者的炎症免疫反应。研究发现,在AT2R基因敲除小鼠上建立动脉粥样硬化、脑缺血再灌注损伤、血管损伤重塑的疾病模型,与正常小鼠相比,AT2R的缺失会导致模型小鼠疾病的恶化。相反,AT2R转基因小鼠的心肌肥大、动脉粥样硬化等疾病表现得到了有效地缓解,提示AT2R可能在疾病病程中发挥保护性作用。利用药理学工具研究发现,AT2R激动剂CGP42112和C21具有舒张血管内皮、抑制炎症反应、促进神经元修复再生等作用。一般而言,当阻断血管紧张素Ⅱ与AT1R的结合时,游离的血管紧张素Ⅱ水平会随之增高,并且反馈性的与另一个受体AT2R作用,继而发挥AT2R的保护性功能,这个假设在氯沙坦治疗主动脉瘤和高血压肾病的研究中都被予以证实。目前AT2R在RA及其实验关节炎动物模型中的作用未见报道。本课题通过建立大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis, AIA)模型,探讨AT2R在AIA炎症免疫反应中的变化和作用,研究AT2R激动剂对实验性关节炎的治疗作用及部分机制,为发现AT2R参与调控RA炎症免疫反应的作用以及成为新靶点的可能性提供实验依据。目的：本课题建立大鼠AIA模型,探讨AT2R在实验性关节炎和RA患者中的变化及其作用,观察关节腔注射AT2R激动剂CGP42112对继发性关节炎的治疗作用,研究AT2R对体外培养的AIA大鼠单核细胞的影响。为明确AT2R在调控RA炎症免疫反应中的作用以及能否成为治疗RA的新靶点提供实验依据。方法： SD大鼠右后足跖皮内注射完全弗氏佐剂(complete Freund's adjuvant,CFA)建立大鼠AIA模型。造模后第14天采用灌胃方式给予AIA大鼠氯沙坦(5,10,15mg/kg),每天给药1次,疗程持续15天,第28天处死大鼠,甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)(0.5mg/kg)作为阳性对照药。观察大鼠多发性关节炎指数和病理组织学评价的变化；采用酶联免疫吸附实验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)法检测大鼠血清、滑膜中肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血管紧张素Ⅱ水平的变化。采用Western blot法检测大鼠脾脏、滑膜中AT1R、AT2R蛋白的表达,并使用Spearman法分析AIA大鼠ATlR、AT2R蛋白表达与多发性关节炎指数的相关性。分离大鼠外周血的单核细胞,采用Western blot法检测大鼠单核细胞AT1R,AT2R蛋白的表达。收集健康志愿者和12例活动期RA患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs),利用定量聚合酶链式反应(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)法和流式细胞术检测AT1R、AT2R的变化。建立AIA大鼠模型(方法同上),采用关节腔注射AT2R激动剂CGP42112(5,10,20μg/kg)观察其对AIA大鼠继发侧左后足关节炎的治疗作用,第14天开始给药,每隔3天给药1次,疗程持续15天,以醋酸曲安奈德(triamcinolone acetonide, TA)(1mg/kg)注射液作为阳性对照药。观察大鼠左后足关节炎指数、关节肿胀度、病理组织学评价、滑膜组织CD11b阳性细胞浸润的变化；分离并体外培养大鼠滑膜细胞,采用CCK-8试剂盒检测滑膜细胞增殖的变化。分离并体外培养模型组大鼠单核细胞,采用Western blot法检测CGP42112(10-6M)和氯沙坦(10-6M)对单核细胞AT1R、AT2R蛋白表达的影响;采用CCK-8试剂盒检测AT2R激动剂CGP42112(10-10至10-5M)对大鼠单核细胞活性的影响；采用Transwell法检测CGP42112(10-8至10-5M)和氯沙坦(10-6M)对大鼠单核细胞趋化的作用。结果： 1.AIA大鼠和RA患者的AT2R表达显著增高,且AT2R表达的上调与AIA大鼠的多发性关节炎指数减轻相关与正常组相比,模型组大鼠多发性关节炎指数显著升高。对于滑膜炎的组织病理学评价表明,模型组大鼠滑膜炎表现为关节腔积液,炎性渗出,滑膜细胞增生,血管翳形成,滑膜组织内小血管增生,大量炎细胞浸润,严重者增生的滑膜组织侵犯软骨表面和软骨下骨。与正常组相比,ELISA检测结果表明,模型组大鼠血清和滑膜中TNF-a、VEGF以及血清中血管紧张素Ⅱ的水平显著升高。Western blot的结果表明,与正常组相比,模型组大鼠脾脏、滑膜中AT1R和AT2R蛋白的表达均显著升高。分离大鼠单核细胞,Western blot的结果表明,与正常组相比,模型组大鼠单核细胞的AT1R、AT2R蛋白表达均显著增高。收集RA患者外周血,qPCR的检测结果表明,与健康志愿者相比,RA患者PBMCs的AT1R和AT2R mRNA水平显著增高。流式细胞术检测的结果进一步表明,RA患者PBMCs的AT1R和AT2R表达显著升高。第22、26天时,与模型组相比,氯沙坦(10,15mg/kg)组和MTX (0.5mg/kg)组大鼠的多发性关节炎指数显著降低。与模型组相比,氯沙坦(15mg/kg)组和MTX (0.5mg/kg)组大鼠的滑膜细胞增生、炎细胞的浸润和血管翳的出现,以及软骨和骨的侵蚀等滑膜炎病理学表现得到显著减轻。与模型组相比,氯沙坦(5,10,15mg/kg)组和MTX (0.5mg/kg)组大鼠的TNF-α、VEGF、血管紧张素Ⅱ水平均得到不同程度的降低。与模型组相比,氯沙坦(5,10,15mg/kg)组和MTX (0.5mg/kg)组大鼠脾脏、滑膜中AT1R蛋白的表达不同程度显著降低；氯沙坦(10,15mg/kg)组大鼠脾脏、滑膜中AT2R蛋白的表达不同程度显著升高。与模型组相比,氯沙坦(15mg/kg)组大鼠单核细胞的AT1R蛋白表达显著降低、AT2R蛋白表达显著增高。对AIA大鼠AT1R、AT2R蛋白表达与多发性关节炎指数的相关性分析表明,脾脏、滑膜中AT1R蛋白表达与多发性关节炎指数呈正相关,即AT1R蛋白表达的上调与多发性关节炎指数的增高相关；而脾脏、滑膜中AT2R蛋白表达与多发性关节炎指数呈负相关,即AT2R蛋白表达的上调与多发性关节炎指数的减轻相关。 2.关节腔注射CGP42112时,激动AT2R可以缓解AIA大鼠体内的继发侧炎症免疫反应初步研究表明AT2R参与了AIA和RA的疾病病程,且高表达的AT2R与大鼠关节炎的缓解密切相关,为了明确AT2R在调控AIA炎症免疫反应中的作用,因此我们在整体给药的情况下进一步研究左后足踝关节腔注射AT2R激动剂CGP42112对AIA大鼠继发侧关节炎的作用。与正常组相比,模型组大鼠继发侧左后足关节炎指数显著升高；第22、26天时,与模型组相比,CGP42112(10,20μg/kg)组和TA(1mg/kg)组大鼠继发侧左后足关节炎指数显著降低。与正常组相比,模型组大鼠继发侧左后足关节肿胀度显著升高；第22、26天时,与模型组相比,CGP42112(10,20μg/kg)组和TA (1mg/kg)组大鼠继发侧左后足关节肿胀度显著降低。组织病理学评价表明,与模型组相比,CGP42112(20μg/kg)组和TA (1mg/kg)组大鼠滑膜炎各单项的病理学评分包括滑膜细胞增生、炎细胞的浸润和血管翳的出现,以及软骨和骨的侵蚀均显著减轻。免疫组化结果表明,与模型组相比,CGP42112(20μg/kg)组和TA (1mg/kg)组大鼠的滑膜组织CDllb阳性细胞浸润明显减轻。与正常组相比,模型组大鼠的滑膜细胞显著增殖；与模型组相比,CGP42112(10,20μg/kg)组和TA (1mg/kg)组大鼠的滑膜细胞增殖受到显著抑制。 3.激动AT2R抑制体外培养的单核细胞活性为了探讨激动AT2R缓解AIA大鼠炎症免疫反应的作用机制,我们分离并体外培养模型组大鼠单核细胞,Western blot的检测结果表明,CGP42112(10-6M)和氯沙坦(10-6M)显著降低单核细胞AT1R蛋白的表达,显著升高大鼠单核细胞AT2R蛋白的表达。CCK-8检测的结果表明,AT2R激动剂CGP42112(10-10至10-5M)对大鼠单核细胞的活性发挥不同程度的抑制作用,其半数抑制浓度(inhibitory concentration50%, IC50)的值为5.21×10-6M。Transwell实验检测的结果表明,CGP42112(10-7至10-5M)和氯沙坦(10-6M)显著减弱胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)和IL-1p诱导的大鼠单核细胞趋化。结论： 1.AIA大鼠脾脏、滑膜组织及单核细胞和RA患者外周血中AT2R表达显著升高,且AT2R表达上调与AIA大鼠多发性关节炎指数减轻相关,提示AT2R在RA病程进展中可能发挥缓解炎症免疫反应的作用。 2.关节腔注射CGP42112改善AIA大鼠继发侧左后足的关节滑膜炎,抑制滑膜细胞增殖,验证激动AT2R可以缓解AIA炎症免疫反应,提示AT2R可能成为RA治疗的新靶点。 3.CGP42112上调AIA大鼠单核细胞AT2R的蛋白表达,激动AT2R可抑制体外培养的AIA大鼠单核细胞活性,提示激动AT2R可能通过抑制单核细胞介导的炎症免疫反应发挥对AIA的治疗作用。
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【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R96

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