fMLP修饰胆固醇构建的脂质体炎症病灶传递系统的研究

发布时间：2019-05-29 11:00

【摘要】：炎症是临床上普遍存在而又非常重要的病理过程，过度的炎症反应对机体是非常有害的。临床上目前使用的抗炎药物主要为甾体类或非甾体类抗炎药，但这类药物均存在作用短暂、易反跳，长期应用有肝肾等毒副作用。因此，构建新的药物传递系统，使药物在炎症病灶选择性浓集，在增强药效的同时减少毒副作用，是药物研究领域需要解决的重要问题之一。 七叶皂苷钠是从中药娑罗子干燥成熟果实中提取的三萜皂苷钠盐，具有明显的抗炎消肿活性。注射用七叶皂苷钠目前已在临床上广泛用于各种疾病的的抗炎消肿，但其静脉给药对血管刺激性强，静注可引起注射部位疼痛，，长时间用药可能引起静脉炎。这些弊端极大地限制了其血管内给药的治疗，即限制了其在脑水肿、肺水肿等深部器官炎性疾病中的运用。更为重要的是，注射用七叶皂苷钠静注后会发挥全身作用，病灶部位特异性差。因此，开发出一种新的疗效好，顺应性强的七叶皂苷钠制剂成为患者及医务工作者的迫切要求。近年来，靶向给药系统因其安全性及顺应性好，疗效显著等优势，成为医药领域的研究热点。N-甲酰-L-甲硫氨酰-L-亮氨酰-L-苯丙氨酸三肽（fMLP）是最早发现的白细胞趋化性肽，最新研究提出fMLP具有强大的白细胞趋化活性，它通过与靶细胞表面的甲酰肽受体（FPR）结合可高效激活吞噬细胞，诱导机体的趋化反应、细胞脱颗粒以及失敏反应等，对机体的炎症反应和天然免疫起着重要作用。基于炎症时白细胞增多的特点，本文在脂质体成分之一的胆固醇上共价修饰fMLP，构建了fMLP修饰的脂质体，并对所构建的脂质体向炎症病灶的传递能力进行了体内外的评价，同时对fMLP修饰脂质体的入胞机制进行了初步的探索，为增强炎症病灶传递提供了新的策略。 本文第一部分设计并构建了白细胞趋化性肽fMLP修饰的脂质体，拟用于提高脂质体向炎症病灶的传递能力。本文将fMLP以NH2-PEG2000-Mal作为桥联与脂质体材料之一的胆固醇共价结合，并采用工艺稳定，操作简单的薄膜分散法制备fMLP修饰的脂质体（fMLP-LIP）。综合脂质体对细胞的亲和力、血清稳定性等因素，确定fMLP的用量占脂质体总脂质摩尔数的3%，保护性聚乙二醇（PEG）占2%。以所筛选出的制备工艺及处方制备的fMLP-LIP粒径在200nm以下。 第二部分制备了香豆素-6标记的fMLP修饰的脂质体（fMLP-LIP）以及两组对照组：普通脂质体（LIP）和长循环脂质体（LLIP），各组脂质体粒径均小于200nm。通过对三种不同脂质体在血清中的稳定性考察发现，不含PEG的LIP组在血清中较不稳定，与含血清的磷酸盐缓冲液（PBS）混合后透光率降低较为明显；而其他两组脂质体没有显著的变化。为了更为直观地评价各组脂质体向炎症病灶的传递能力，本章对香豆素-6标记的脂质体进行了体外细胞摄取的考察。巨噬细胞表面已被证明表达有甲酰肽的受体，是体外研究甲酰肽的极好模型。但由于巨噬细胞属于不繁殖细胞，本文用0.1μg/ml的佛波醇酯（PMA）刺激分化U937细胞为巨噬样细胞作为体外研究对象，考察了细胞对各组脂质体的摄取能力。结果表明，分化后的U937细胞对fMLP-LIP的摄取明显高于LIP和LLIP组。同时进一步通过分化后的U937细胞对fMLP-LIP在低温条件下的摄取显著降低（P0.01），表明其入胞过程依赖于能量。游离的fMLP对其细胞摄取也表现出了显著性的抑制，其是否通过受体介导的转运还需要进一步验证。 第三部分主要对fMLP-LIP向炎症病灶的传递能力进行了体内评价。本部分选用近红外染料DIR作为荧光探针标记脂质体，对不同脂质体向炎症病灶的传递能力进行定性的体内评价。通过小鼠活体及离体组织荧光成像可以观察到，fMLP的引入大大增加了脂质体在炎症病灶的蓄积。同时，fMLP-LIP在肝、脾、肾等脏器也有一定的分布。结果表明，与对照组相比，fMLP的引入能够增加脂质体向炎症病灶的传递，但并没有减少其在肝、肾等脏器的分布。 第四部分将已经构建的fMLP-LIP用于抗炎药物β-七叶皂苷钠的药效学评价。本部分首先对载β-七叶皂苷钠脂质体的处方及制备工艺进行考察，确定载β-七叶皂苷钠脂质体的制备采用薄膜分散－超声法，固定胆固醇与磷脂的比例为1

本文编号：2487893