重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达

发布时间：2020-03-16 05:42

【摘要】：【目的】瑞替普酶(重组组织纤溶酶原激活物,rt PA)被认为是第三代安全有效的溶栓剂,以p PIC9K为载体,以3种不同表型的毕赤酵母(Pichia pastoris)为宿主,探索适合rt PA分泌型表达的最佳体系。【方法】以质粒p ET28a-rt PA为模板,设计特异性引物,PCR扩增目的基因rt PA,插入分泌型表达载体p PIC9K中,获得重组表达质粒p PIC9K-rt PA。重组质粒经限制性内切酶Sal I线性化后,电击转化至3种不同表型的P.pastoris(GS115、SMD1168、KM71)中进行组成型表达;重组表达体系进行甲醇诱导表达,对产物进行Western blot鉴定,并采用纤维蛋白平板溶圈法测定其活性。【结果】重组蛋白分子量约为43 k D;rt PA-GS115和rt PA-KM71均在39 k D处有特异性条带,且前者在32 k D处有轻微降解条带,而后者并无此现象;rt PA-SMD1168无降解现象,且rt PA-SMD1168比活性较rt PA-GS115高27%;rt PA-KM71表达量和活性均为最低。【结论】从重组蛋白生物活性出发,P.pastoris SD1168可作为rt PA的最佳表达体系,在控制宿主蛋白酶活性、减少产物降解的前提下,P.pastoris GS115也是rt PA表达的优选体系。
【图文】：

张旦旦等:重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达2149Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn图1重组质粒pMD19-T-rtPA和pPIC9K-rtPA的构建与验证Figure1ConstructionandverificationofrecombinantplasmidpMD19-T-rtPAandpPIC9K-rtPANote:M1:DL5000marker;M2:λ-HindIIImarker;M3:DL2000marker;1:rtPA;2:DigestionbandsofpMD19-T-rtPA;35:DigestionbandsofpPIC9K-rtPA.不同表型的P.pastorisGS115、SMD1168和KM71为表达宿主，以分泌型表达质粒pPIC9K为载体，构建3种毕赤酵母分泌表达体系。以限制性内切酶SalI消化重组质粒pPIC9K-rtPA，使其线性化(目的条带约10.3kb)，并将其分别电击转化至3株毕赤酵母的感受态细胞中，转化物涂布于MD-G418平板，于30°C培养4872h至长出单菌落；挑取单菌落，以P1、P2为引物进行菌落PCR验证(图2)，结果表明重组菌构建成功。挑取阳性菌落在MD-G418平板上分离纯化3次以上得到纯菌落。图2重组菌的菌落PCR验证Figure2PCRverificationofrecombinantstrainsNote:M:DL5000DNAmarker;1:P.pastorisGS115;26:TransformantofP.pastorisGS115;7:P.pastorisSMD1168;812:TransformantofP.pastorisSMD1168;13:P.pastorisKM71;1417:TransformantofP.pastorisKM71.

张旦旦等:重组瑞替普酶在毕赤酵母中的表达2149Tel:010-64807511;E-mail:tongbao@im.ac.cn;http://journals.im.ac.cn/wswxtbcn图1重组质粒pMD19-T-rtPA和pPIC9K-rtPA的构建与验证Figure1ConstructionandverificationofrecombinantplasmidpMD19-T-rtPAandpPIC9K-rtPANote:M1:DL5000marker;M2:λ-HindIIImarker;M3:DL2000marker;1:rtPA;2:DigestionbandsofpMD19-T-rtPA;35:DigestionbandsofpPIC9K-rtPA.不同表型的P.pastorisGS115、SMD1168和KM71为表达宿主，以分泌型表达质粒pPIC9K为载体，构建3种毕赤酵母分泌表达体系。以限制性内切酶SalI消化重组质粒pPIC9K-rtPA，，使其线性化(目的条带约10.3kb)，并将其分别电击转化至3株毕赤酵母的感受态细胞中，转化物涂布于MD-G418平板，于30°C培养4872h至长出单菌落；挑取单菌落，以P1、P2为引物进行菌落PCR验证(图2)，结果表明重组菌构建成功。挑取阳性菌落在MD-G418平板上分离纯化3次以上得到纯菌落。图2重组菌的菌落PCR验证Figure2PCRverificationofrecombinantstrainsNote:M:DL5000DNAmarker;1:P.pastorisGS115;26:TransformantofP.pastorisGS115;7:P.pastorisSMD1168;812:TransformantofP.pastorisSMD1168;13:P.pastorisKM71;1417:TransformantofP.pastorisKM71.

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本文编号：2587344