青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒的制备及其通过线粒体介导促进细胞凋亡的研究

发布时间：2020-03-19 09:51

【摘要】：目的肿瘤是人类面临最严重的疾病之一,其具有侵袭性强、瘤体增长迅速、对抗化疗和术后复发率高等特点,在全球范围内影响人类健康。因此,研制安全、有效的药物传递系统和治疗方法来对抗肿瘤十分迫切和必要。近年来研究表明,青蒿素及其衍生物被认为具有广泛的抗肿瘤活性,且具有明显的抗肿瘤作用。查阅相关文献得知青蒿琥酯具有一定的抗肿瘤活性,但呈浓度依赖性,低浓度的青蒿琥酯(Ats)抗肿瘤作用不理想,但浓度过高会产生骨髓抑制等副作用。为了获得更好的抗肿瘤效果,本实验采用青蒿琥酯作为模型药物,以牛血清白蛋白(BSA)为载体,制备青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒。以SMMC-7721和PLC细胞株为研究对象,分析和研究了青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒(Ats-BSA-NPs)对肿瘤细胞线粒体的靶向作用及体外抗肿瘤活性。方法采用去溶剂化法以牛血清白蛋白为载体材料,制备青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒。采用单因素考察法对青蒿琥酯溶液浓度、牛血清白蛋白溶液的浓度及青蒿琥酯溶液的滴加速度等进行筛选分析,获得最优处方工艺。对该纳米粒进行相关体外表征,包括外观、粒径、Zeta电位和释放度等。采用MTT比色分析法检测不同时间间隔游离青蒿琥酯与青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒对肿瘤细胞活力的影响。用激光共聚焦扫描显微镜观察JC-1染料荧光强度的变化,观察游离青蒿琥酯溶液和Ats-BSA-NPs处理后肿瘤细胞线粒体膜电位的变化,随后对其细胞内活性氧(ROS)的产生情况进行定量分析,最后用Western Blot考察游离青蒿琥酯溶液和Ats-BSA-NPs对细胞相关凋亡蛋白及细胞色素C的调节情况。结果通过单因素考察得到最佳处方为青蒿琥酯溶液浓度500μg/mL,牛血清白蛋白溶液浓度35 mg/mL,青蒿琥酯溶液的滴加速度30滴/min,按照最优处方获得的纳米粒的包封率值为82.4%,载药量值为13.3%,包封率及载药量良好。将Ats-BSA-NPs进行表征分析,透射电镜下的Ats-BSA-NPs呈完整的球形,分散指数为0.016,平均粒径为99.9±2.3 nm,结果表明纳米粒大小均匀呈良好的分散状态。纳米粒的Zeta电位为负值,大小为-25.6±4.3 mV。与游离药物在体外的快速释放相比,Ats-BSA-NPs释放速度较缓慢,并且由于Ats-BSA-NPs的持续降解,表现出一种平稳而持久的释放模式。MTT实验结果表明与游离的青蒿琥酯相比较,Ats-BSA-NPs对SMMC-7721肿瘤细胞和PLC肿瘤细胞具有更强的细胞毒性和更高的灵敏度,对肿瘤细胞具有更强的抑制作用。通过共聚焦显微镜观察两种肿瘤细胞内的纳米粒的分布和定位,结果表明Ats-BSA-NPs能够靶向到线粒体上并使线粒体膜受到严重损伤,导致线粒体膜去极化。肿瘤细胞被游离药物和Ats-BSA-NPs处理一定时间后,细胞内ROS含量也随之增加,呈现时间依赖性关系,并且由Ats-BSA-NPs处理过的细胞产生的ROS明显较多,说明Ats-BSA-NPs具有更强的杀伤力。为了探讨细胞死亡对游离药物和Ats-BSA-NPs诱导的细胞凋亡的相互关系,本实验采用Western Blot方法检测细胞凋亡蛋白的表达。通过实验结果发现,青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒实现了在线粒体内的积累,激活线粒体介导的凋亡效应,从而提高了Caspase-3和Caspase-9相关凋亡蛋白的表达导致明显的细胞凋亡。结论本实验以牛血清白蛋白为载体,采用去溶剂化法制备的青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒,粒径呈完整的球形,大小均匀,且具有良好的缓释效果。通过荧光摄取实验、MTT和流式细胞术及Western Blot等体外抗肿瘤实验进行了初步的探讨和研究,表明青蒿琥酯可以通过牛血清白蛋白纳米粒靶向到线粒体,破坏线粒体的完整性导致膜电位下降从而促进细胞凋亡,增强了青蒿琥酯抗肿瘤活性。
【图文】：

收率测定青蒿琥酯溶液，将其制备成高、中、低三种浓度（2.0、1.0、0.，于一天内分别测定 3 次取其平均吸光度值，根据标准曲琥酯溶液浓度，计算回收率。青蒿琥酯含量测定方法的建立大吸收波长的选择《中国药典》2015 年版青蒿琥酯项下方法，选择检测波长为准曲线的绘制示，根据回归方程 A=0.1572C+0.0055，相关系数 r=0.999 0.05-2.5 mg/mL 范围内呈良好的线性关系。

琥酯溶液浓度的选择琥酯溶液的增加，纳米粒的载药量和包封率呈先增加后 500 μg/mL 时，载药量开始呈现下降趋势，，所以最终选 500 μg/mL。琥酯溶液滴加速度的选择琥酯溶液滴加速度的增加，包封率不断增大，但当滴速率呈降低趋势，所以最终选择 30 滴/min 为最佳滴加青蒿琥酯牛血清白蛋白纳米粒的表征分析学考察观察到，Ats-BSA-NPs 分散均匀，呈完整的球形或类
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96;R943;TB383.1

【参考文献】

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1 赵润鹏;青蒿琥酯调节肝癌细胞自噬机制及对细胞生长的影响[D];安徽理工大学;2017年

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10 朴智;青蒿琥酯对耐药性腺样囊性癌NACC-DDP细胞与其亲本细胞增殖的影响及相关机制研究[D];广西医科大学;2014年

本文编号：2590067