基于法尼醇X受体探究橙皮苷对胆汁淤积的治疗作用及机制

发布时间：2020-03-23 00:17

【摘要】：目的(1)基于分子对接实验考察橙皮苷(Hesperidin,HP)与法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)之间的相互作用;(2)在体外及体内水平,基于FXR探究橙皮苷对胆汁淤积的治疗作用及机制。方法(1)使用Glide软件包中对FXR和橙皮苷进行分子对接,考察橙皮苷与FXR受体之间的相互作用。(2)采用橙皮苷干预正常HepaRG细胞及Si-FXR沉默细胞,两种细胞的分组及处理方式相同,具体如下:(1)对照(Control)组:含0.2%DMSO的无血清培养基;(2)橙皮苷(HP)组:含12.5 umol/L橙皮苷的无血清培养基;(3)胆酸盐干预(BAs)组:含50倍正常人血清中胆酸盐水平的无血清培养基;(4)橙皮苷与胆酸盐混合干预(HP+BAs)组:含50倍正常人血清中胆酸盐与12.5 umol/L橙皮苷的无血清培养基;(5)奥贝胆酸与胆酸盐混合干预(OCA+BAs)组:含50倍正常人血清中胆酸盐与2 umol/L奥贝胆酸的无血清培养基,每组干预时间均为24 h。测定总胆汁酸(TBA)、谷草转氨酶(AST)和谷丙转氨酶(ALT)的含量及HE和F-actin免疫荧光染色考察各组细胞形态变化,并考察转运体钠离子/牛磺胆酸共转运蛋白(Na~+/taurocholate cotransporting polypeptide,NTCP)、胆盐外排泵(bile salt export pump,BSEP)、多药耐药相关蛋白2(multidrug resistance-associated protein2,MRP2)、有机阴离子转运多肽1B1(organic anion-transporting polypeptides1B1,OATP1B1),细胞色素P450酶系7α-羟化酶(cholesterol 7α-hydroxylase,CYP7A1)以及核受体FXR的mRNA表达。(3)C57BL/6J雄性小鼠70只,体重18-25 g,随机分为7组,每组10只。具体分组及处理如下:(1)对照(Control)组:灌胃给予溶媒(0.5%羧甲基纤维素钠溶液);(2)单给橙皮苷(HP)组:灌胃给予橙皮苷100 mg/kg;(3)模型(ANIT)组:灌胃给予溶媒(0.5%羧甲基纤维素钠溶液);(4)低剂量橙皮苷治疗(HP 25mg/kg+ANIT)组:灌胃给予橙皮苷25 mg/kg;(5)中剂量橙皮苷治疗(HP 50mg/kg+ANIT)组:灌胃给予橙皮苷50 mg/kg;(6)高剂量橙皮苷治疗(HP 100mg/kg+ANIT)组:灌胃给予橙皮苷100 mg/kg;(7)奥贝胆酸治疗(OCA 10mg/kg+ANIT)组:灌胃给予奥贝胆酸10 mg/kg。上述各组均每天给药一次,连续7天,并在实验第5天,除Control组和HP组灌胃给予等量的溶媒(植物油)外其余各组小鼠均单次灌胃给予α-异硫氰酸酯(ANIT)75 mg/kg。于实验第7天各组灌胃给予相应药物后,禁食4 h,摘单侧眼球取血,颈椎脱臼处死。摘取胆囊,采集肝脏和十二指肠。测定血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、总胆汁酸(TBA)、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸化酶(ALP)和γ-谷氨酰基转移酶(γ-GT)水平及不同组织TBA含量;肝脏部分组织采用HE染色进行病理学评价,部分采用RT-qPCR技术考察转运体Ntcp、Bsep、Mrp2和Oatp1a1、代谢酶Cyp7a1和Cyp27a1及核受体Fxr和小异二聚体伴侣(small heterodimer partner,Shp)的mRNA表达。结果(1)分子对接结果显示,橙皮苷和FXR受体的对接打分为-9.443 Kcal/mol,该得分介于FXR受体最优激动剂得分-13.985 Kcal/mol和已知的FXR激动剂OCA得分-9.057 Kcal/mol之间,并且橙皮苷和FXR对接时的氢键、疏水作用以及橙皮苷在FXR受体催化结构域中的结合作用均表明橙皮苷与FXR受体的结合作用方式利于受体蛋白功能的实现。(2)细胞实验结果显示,与BAs组相比,HP+BAs组HepaRG细胞生存率显著提高(p0.01),TBA水平显著降低(p0.05),SiFXR+HP+BAs组的AST水平显著上升(p0.05)。但HE与肌动蛋白(F-actin)染色结果显示各组细胞形态均无明显差异。相较于BAs组,HP+BAs组NTCP与CYP7A1的表达均显著降低(p0.05),MRP2与FXR的表达均显著升高(p0.05),BSEP的表达有上升趋势,但无显著差异(p0.05)。(3)动物实验结果显示,与ANIT组相比,100 mg/kg HP+ANIT组的肝重与胆重指数均显著降低(p0.05),100 mg/kg HP+ANIT组的AST、ALT、TBIL与ALP均显著下降(p0.05)。各剂量HP+ANIT组中血清、肝脏和胆囊中TBA水平相较于ANIT组均显著下降(p0.01),十二指肠中TBA水平较ANIT组具有上升趋势,但无统计学差异。各剂量HP+ANIT组肝脏组织病理学变化较ANIT组有所改善。在RT-qPCR实验结果中,与ANIT组相比,50 mg/kg HP+ANIT组的Ntcp显著降低(p0.05);100 mg/kg HP+ANIT组的Oatp1a1显著升高(p0.05);HP 50 mg/kg+ANIT组及HP 100 mg/kg+ANIT组Bsep和Mrp2的表达均显著升高(p0.01);各剂量HP+ANIT组Cyp7a1及Cyp27a1的表达均显著降低(p0.05),Fxr与Shp的表达均显著升高(p0.05)。结论(1)在分子对接实验中,橙皮苷分子能够通过ARG264和HIE447两个氢键与FXR受体进行牢固对接,并且与FXR激动剂OCA的对接分数相近,推测橙皮苷具有激动FXR的作用。(2)细胞实验结果表明,给予12.5 umol/L橙皮苷干预HepaRG细胞24 h后,能明显缓解细胞内胆酸盐的蓄积毒性;将HepaRG细胞FXR沉默后,发现橙皮苷的作用消失,推测其减毒机制可能与激动FXR有关。(3)动物研究结果表明,不同剂量的橙皮苷对ANIT诱导的胆汁淤积小鼠具有治疗作用,其中高剂量橙皮苷治疗组作用最为显著,且与OCA疗效接近,其治疗机制可能与橙皮苷激动Fxr受体,进而调控其下游靶基因的表达有关。
【图文】：

图 1-1 胆酸盐肝肠循环[5]Fig 1-1 The enterohepatic circulation of bile acid salt.2 胆酸盐对肝细胞的损伤机制胆酸盐结构中极性基团的数量、位置和构型以及侧链与甘氨酸或牛磺酸的酰会极大地影响 BAs 的疏水性，是决定胆酸盐毒性大小的重要因素[15]。具有羟基的胆汁酸通常更疏水，反之亦然。有文献报道，疏水性胆酸盐如 CDCA 和 LCA 在肝细胞中的蓄积是造成胆汁淤积型肝损伤的主要原因之一6]。此外，疏水性胆汁酸已被确定为导致结肠癌和肝癌的重要致病因子[15]表明，疏水性胆酸盐可通过破坏细胞膜的结构而诱导细胞发生氧化应激，最能导致肝细胞凋亡[13]。另有研究认为，疏水性胆酸盐会使得肝细胞膨胀肿细胞内胆红素大量蓄积，，同时也会对线粒体功能造成一定影响，并最终对肝造成损伤[17,18]。（1）胆酸盐诱导细胞死亡机制：细胞内一定浓度的胆酸盐可通过诱导细胞而最终导致细胞死亡。疏水性胆酸盐能够激活或增加死亡受体 Fas 蛋白的表

化合物橙皮苷的对接构象的 2D 图（图片由 MAESs representing the docked conformation of compoundcaptured by MAESTRO）在 FXR 催化结构域中的结合作用（PYMOL 可视
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2595848