基于高分子铜螯合剂的纳米载药体系联合血管生成抑制与免疫疗法靶向治疗乳腺癌的研究

发布时间：2020-03-25 07:02

【摘要】：目的乳腺癌是一种女性常发的肿瘤,近年来其发病率不断上升,为公共健康带来了极大威胁。研究表明,血管新生和免疫抑制在乳腺癌的生长和转移方面发挥重要作用。因此,抗血管生成联合免疫疗法被认为是一种很有前景的乳腺癌治疗策略。本研究以PEG-b-PGA为基本骨架构建了具有铜离子螯合能力的嵌段聚合物RPTDH,通过疏水作用有效携载Toll样受体7/8(TLR7/8)特异性激动剂瑞喹莫德(R848),成功制备了一种具有pH敏感性与肿瘤主动靶向功能的纳米载药体系RPTDH/R848,从而将抗血管生成与免疫疗法有效结合,以期实现对乳腺癌的协同治疗作用。内容本论文的研究内容分为三部分。第一部分为纳米载药体系RPTDH/R848的制备与表征,主要包括RPTDH的合成与化学结构的表征,RPTDH的铜离子螯合能力考察,RPTDH纳米粒的制备及其pH敏感性的考察,RPTDH/R848纳米粒子的制备及其载药与释药性能的考察。第二部分为RPTDH/R848纳米粒子的体外研究,主要包括细胞毒作用、免疫细胞激活、细胞迁移、侵袭及抗血管生成能力的考察及其抗血管生成机制的初步探讨。第三部分为RPTDH/R848纳米粒子的体内研究,主要包括4T1乳腺癌原位小鼠肿瘤模型的构建、RPTDH/R848纳米粒子在小鼠体内的组织分布和其抗肿瘤能力、抗血管生成及免疫激活作用的体内评价。方法1.RPTDH/R848纳米粒子的制备与表征:通过多步化学反应制备高分子铜螯合剂RPTDH,并利用傅里叶红外光谱(FT-IR)、核磁共振氢谱(~1H NMR)与电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)对其进行化学结构的表征与含硫量的检测;利用凝胶渗透色谱(GPC)测定其分子量;通过紫外分光光谱(UV)及原子吸收光谱考察高分子材料RPTDH对Cu~(2+)的螯合能力;通过纳米沉淀法制备RPTDH和RPTDH/R848纳米粒子,并通过超高效液相色谱(UPLC)测定RPTDH/R848的载药量和包封率;通过粒径和Zeta电位分析仪检测纳米粒子的粒径、粒径分布和表面电荷性质;利用透射电子显微镜(TEM)测定纳米粒子的形貌;通过~1H NMR、TEM和荧光芘探针法考察RPTDH纳米粒子的pH响应性;通过动态透析法考察RPTDH/R848在不同pH释放介质中的体外药物释放特征。2.RPTDH/R848纳米粒子的体外研究:通过MTT实验检测RPTDH和RPTDH/R848对人脐静脉内皮HUVEC细胞、小鼠乳腺癌4T1细胞、人乳腺癌MCF-7细胞、人乳腺癌MDA-MB-231细胞和人正常肺上皮BEAS-2B细胞的毒性作用;通过对HUVEC细胞进行Transwell、划痕实验和成管实验,考察RPTDH/R848体外抗血管生成作用;RPTDH/R848纳米粒抗血管生成作用的机制探讨:HUVEC细胞和MDA-MB-231细胞经RPTDH/R848处理后,利用Western-blotting检测核质分离得到的细胞核和细胞质蛋白中NF-κB的表达情况,通过激光共聚焦显微镜考察不同处理后NF-κB在HUVEC细胞和MDA-MB-231细胞中的亚细胞定位情况;采用ELISA试剂盒测定促血管新生因子白介素-1α(IL-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)、白介素-8(IL-8)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的分泌情况;通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测TNF-α、IFN-α、IL-6以及IL-12p40 mRNA的表达水平,通过流式检测人浆细胞样树突状细胞系CAL-1细胞表面CD80、CD86和CD83的表达情况,考察RPTDH/R848对CAL-1细胞的激活作用。3.RPTDH/R848纳米粒子的体内研究:通过将4T1-Luc细胞皮下种植于小鼠乳腺脂肪垫构建乳腺癌转移模型;IR780是一种近红外荧光染料,可被包载入RPTDH制备RPTDH/IR780纳米粒,利用小动物活体成像技术检测RPTDH/IR780纳米粒在肝、肾、脾、肺和肿瘤组织中的蓄积情况,综合评价纳米体系的肿瘤靶向性;尾静脉注射RPTDH/R848纳米粒,考察其体内抗肿瘤作用;治疗结束后,乳腺癌荷瘤小鼠腹腔注射荧光素酶底物,可通过活体成像系统考察乳腺癌肺部转移情况;对治疗后小鼠的肝、肾和脾进行病理学检查,并利用免疫组化检测肿瘤组织凋亡和抗血管生成情况,综合评价RPTDH/R848纳米粒子对乳腺癌的协同治疗作用。结果1.成功合成并表征了高分子铜螯合剂RPTDH;~1H NMR、TEM和荧光芘探针结果显示RPTDH纳米粒子具有显著的pH敏感性;利用纳米沉淀法成功制备了RPTDH和RPTDH/R848纳米粒,TEM结果显示其呈规则球形结构;体外药物释放结果显示,RPTDH/R848载药纳米体系中R848的释放具有明显的pH响应性。2.RPTDH/R848纳米粒子可通过对Cu~(2+)的螯合实现对肿瘤细胞生长的抑制;RPTDH/R848通过抑制NF-κB的核转位抑制促血管新生因子的分泌,从而降低HUVEC细胞的成管能力;RPTDH/R848可激活CAL-1细胞,引起细胞因子TNF-α、IFN-α、IL-6以及IL-12p40 mRNA表达升高,同时,CAL-1细胞表面CD80、CD86和CD83分子表达升高。3.成功构建了小鼠乳腺癌转移模型,经尾静脉注射RPTDH/IR780,24 h后,该纳米体系主要分布于小鼠的肿瘤组织和肺部转移灶,显示出良好的体内乳腺癌靶向作用;动物体内实验结果表明RPTDH/R848能联合抗血管生成与免疫疗法有效抑制乳腺癌的生长和转移。结论本研究设计并成功构建了一种具有肿瘤靶向性和pH-响应性的高分子纳米载药体系RPTDH/R848,该纳米体系同时携载了铜螯合剂与免疫激动剂R848,在体外实现了R848的pH-响应性释放。在细胞水平,RPTDH/R848诱导的铜缺乏可调控NF-κB信号通路,进而抑制血管新生,同时RPTDH/R848可有效诱导人髓样树突状CAL-1细胞的成熟与活化。在4T1-荷瘤小鼠体内,RPTDH纳米粒子表现出良好的肿瘤靶向性,并对体内肿瘤的生长和转移具有显著的抑制作用。综上,RPTDH/R848纳米粒子通过联合抗血管生成与免疫疗法实现了对乳腺癌的协同治疗,为乳腺癌的临床治疗提供了新的策略。
【图文】：

纳米粒

天津医科大学硕士学位论文酸性条件下，具有 pH-响应性断键性能的苯甲酰亚胺键发生断裂，同时 PHis 发生疏水/亲水性转变，触发纳米粒解体并释放 R848，进而激活 TLR7/8 信号通路介导的抗肿瘤免疫；断裂的聚合物片段 γ-PGA-g-(TETA-DTC-PHis) 螯合肿瘤微环境中的 Cu2+，造成铜缺乏并阻断肿瘤血管生成，进而抑制肿瘤生长与转移。

路线图,路线,质子,伸缩振动

图 1.1 RPTDH 的合成路线RPC 的1H NMR 谱以及各特征质子信号的归属如图 1.2（A）所示。RPC 的1H NMR 谱图中，PEG 的-CH2质子峰出现在 3.50 ppm处，，4-CB 的苯环上的-CH质子峰出现在 7.80 ppm处，4-CB 的-CHO 质子峰出现在 9.88 ppm处，RGD 由于含 H 较少，因此特征质子峰峰较弱。RPC 的红外谱图以及各特征峰的归属如图 1.2（B）所示。RPC 的 IR 谱图中，2876 cm-1处出现的峰是 C-H（PEG 的-CH2）的伸缩振动峰，1669.1 cm-1处出现的峰是 C-O 伸缩振动峰，1560.6 cm-1处出现的峰是 C=C 的伸缩振动峰，845.0 cm-1处出现的峰是 C-H 的弯曲振动峰。上述结果说明我们成功合成了 RPC。γ-PGA、BPT、PTDH 和 RPTDH 的1H NMR 波谱图和 FT-IR 图谱如图 1.3所示。如图 1.3（A）所示，1H NMR 谱图中 γ-PGA、BPT、PTDH 和 RPTDH 的特征质子峰清晰可见。如图 1.3（B）所示，BPT 和 γ-PGA 相比，2950.4 cm-1归属于 TETA 中亚甲基的伸缩振动，1559.8 cm-1处的特征峰归属于 γ-PGA 与 TETA
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R737.9;R943

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