脊髓背角SNARE复合物在慢性炎性疼痛中的作用

发布时间：2020-03-27 04:01

【摘要】：目的:可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors,SNARE)介导的膜融合在囊泡运输及神经递质释放中发挥重要作用。最近的研究证实,包括N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)型谷氨酸受体在内的突触后受体的膜运输,也依赖于SNARE蛋白介导的胞吐作用(Exocytosis)。现已知,NMDA受体在痛觉敏化中发挥关键作用,SNARE复合物也参与突触可塑性。然而,脊髓背角浅层神经元中SNARE复合物确切的组成形式及其功能尚不明确。本研究将探讨脊髓背角SNARE复合物的主要组成及其在慢性炎性疼痛中的可能作用。方法:采用免疫荧光组织化学法观察脊髓背角SNAP25的分布;利用免疫共沉淀、免疫印迹法调查大鼠脊髓背角SNARE蛋白家族之间的相互作用;大鼠足底皮下注射完全弗氏佐剂(Complete Freund's Adjuvant,CFA)建立慢性炎性疼痛模型,通过鞘内注射可干扰SNARE复合物形成的多肽pep-SNAP25,探究外周炎症对脊髓背角SNARE核心复合物组装的调控作用;利用免疫共沉淀、免疫印迹、膜蛋白生物素标记法、行为学等方法,探究脊髓背角SNARE复合物参与痛觉调控的分子机制。结果:(1)免疫组织化学结果显示,SNAP25大量分布在脊髓灰质浅层的背角神经元中,并且与突触后标记物PSD95(postsynaptic density protein of 95 kDa)呈共分布,而其同源蛋白SNAP23主要分布在脊髓白质周围的神经纤维束中;(2)用抗SNAP25特异性抗体可从大鼠脊髓背角裂解液中免疫共沉淀出syntaxin1、syntaxin2、syntaxin3、syntaxin4、VAMP1、VAMP2、Munc18-1、Munc18-2和Munc18-3,但所沉淀出的syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相对含量远远高于它们的同源物;(3)用抗syntaxin4特异性抗体也可从大鼠脊髓背角裂解液中免疫共沉淀出SNAP25、VAMP2和Munc18-1,提示:在脊髓背角,SNAP25、syntaxin4、VAMP2和Munc18-1可主导性组成SNARE核心复合物;(4)足底皮下注射CFA可显著增加SNAP25免疫共沉淀物中syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相对含量;(5)足底皮下注射CFA也可显著增加syntaxin4免疫共沉淀物中SNAP25、VAMP2和Munc18-1的相对含量,提示:外周炎症可促进脊髓背角SNAP25/syntaxin4/VAMP2/Munc18-1核心复合物的组装;(6)鞘内给予γ-氨基丁酸A型受体(γ-aminobutyric acid type A receptor,GABA_A受体)拮抗剂bicuculline(0.5μg)或NMDA受体激动剂NMDA(1.0μg),可显著提升SNAP25免疫共沉淀物中syntaxin4、VAMP2和Munc18-1的相对含量;(7)鞘内给予NMDA受体拮抗剂D-APV(1.0μg),可显著抑制bicuculline增强SNAP25与syntaxin4、VAMP2、Munc18-1相互作用的效应,表明:脊髓背角SNARE复合物的组装受到神经活动及NMDA受体活性的密切调控;(8)鞘内注射能干扰SNARE蛋白间相互作用的多肽pep-SNAP25,可显著抑制炎性大鼠包含GluN2B亚基的NMDA受体(GluN2B subunit-containing NMDA receptors,GluN2BRs)的膜表达和突触表达,提示:SNARE复合物在GluN2B受体的胞吐作用中发挥重要作用;(9)鞘内注射pep-SNAP25能剂量依赖性地抑制CFA所引发的机械性缩足阈值(paw withdrawal thresholds,PWTs)和热缩足潜伏期(paw withdrawal latencies,PWLs)的降低,提示:干扰SNAP25/syntaxin4/VAMP2/Munc18-1复合物可有效抑制慢性炎性疼痛。结论:在脊髓背角神经元中,SNAP25、syntaxin4、VAMP2和Munc18-1可主导性组成SNARE复合物。外周炎症可促进此复合物的组装,进而调控NMDA受体的胞吐作用,提高突触表达。干扰此复合物的形成可缓解外周炎症诱发的机械性痛觉超敏与热痛觉过敏。
【图文】：

第三章 实验结果3.1 SNAP25在脊髓背角的分布SNAP25及其同源蛋白SNAP23，是普遍存在于中枢神经系统SNARE复合物的主要组分，并已被证实在突触后膜受体的胞吐中发挥重要作用[27]。因此，我们首先利用免疫组织化学，考察了这两种蛋白在脊髓背角的分布特点。正常大鼠L4-L5节段脊髓切片，用抗SNAP25或SNAP23的特异性抗体与突触后标记物PSD95的特异性抗体进行免疫荧光双标记染色。结果显示：SNAP25大量分布于脊髓背角灰质中，且主要分布在灰质浅层神经元 (图3-1)。同时，在灰质周围的神经纤维束中也有分布。通过SNAP25和PSD95荧光染色图像的叠加，，我们发现：在脊髓背角I/II板层，大多数SNAP25和突触后PSD95呈现共分布 (图3-1)。大多数呈点状排列的SNAP25阳性物与PSD95相互重合或接近 (图3-1)，提示：SNAP25可表达于脊髓背角浅层的突触后神经元。

图3-2 SNAP23在脊髓背角的分布。左侧图依次显示SNAP23、PSD95的免疫染色低倍采集图像 (比例尺：100 μm)；最右侧图代表SNAP23 (红光) 和PSD95 (绿光) 叠加后的高倍镜采集图像 (比例尺：20 μm)。3.2 脊髓背角SNARE复合物的组成为了进一步鉴定与SNAP25可能形成复合物的其它SNARE成员及其辅助因子的种类，本实验采用免疫共沉淀法，研究了SNAP25与syntaxins、VAMPs和Munc18s的相互作用。3.2.1 SNAP25与syntaxins的相互作用Syntaxins是一类参与胞吐作用的膜整合Q-SNARE蛋白家族，为了探讨脊髓背角SNAP25和syntaxins (syntaxin1-4) 蛋白的相互作用。取正常成年大鼠，分离L4-L5脊髓节段，制备全细胞裂解液。将裂解液与anti-SNAP25的特异性抗体孵育，进行免疫共沉淀，检测沉降出的syntaxin1 (STX1)、syntaxin2 (STX2)、syntaxin3(STX3) 和syntaxin4 (STX4) 蛋白的相对含量，IgG作为阴性对照。结果显示：Anti-SNAP25特异性抗体可不同程度地从脊髓背角裂解液中共沉
【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R96

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本文编号：2602430