IDR-1018联合美罗培南或舒巴坦的抗菌及抗生物膜活性研究

发布时间：2020-04-02 10:03

【摘要】：目的:(1)构建鲍曼不动杆菌(AB)标准菌株ATCC BAA-1605的生物膜模型并测定其生长曲线及生物膜形成曲线。(2)检测抗菌药物美罗培南、头孢哌酮钠、头孢哌酮/舒巴坦钠、舒巴坦及抗菌肽IDR-1018对ATCC BAA-1605菌株的最低抑菌浓度(MIC)。(3)明确IDR-1018联合美罗培南或舒巴坦的抗菌作用。(4)探究美罗培南、舒巴坦及IDR-1018对AB生物膜形成的抑制作用及对已形成生物膜的破坏作用。方法:(1)构建AB生物膜模型并测定其生长曲线及生物膜形成曲线:96孔板中培养AB,每2h取出200μl,于600nm处测量吸光度值,得到AB生长曲线;于聚氯乙烯(PVC)材质的96孔板中培养AB,每24h取出一组(每组3孔),结晶紫染色法观察生物膜,建立AB生物膜模型并得到生物膜形成曲线。(2)微量肉汤稀释法分别检测美罗培南、头孢哌酮钠、头孢哌酮/舒巴坦钠、舒巴坦及抗菌肽IDR-1018对ATCC BAA-1605菌株的最低抑菌浓度(MIC)。(3)微量棋盘稀释法确定IDR-1018联合美罗培南或舒巴坦的抗菌作用。(4)以PVC材料为载体、Luria-Bertani(LB)培养基为液体培养基,将菌液接种于载体上,37℃静置培养,分别于0h及24h予美罗培南、舒巴坦及IDR-1018单独或联合干预24h,结晶紫染色法及激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)观察生物膜形态及生物膜内活/死菌数量变化。结果:(1)AB接种至LB液体培养基后,0~4h为生长迟缓期,4h后进入对数生长期,直至14h左右细菌进入稳定生长期;AB于PVC 96孔板中培养至24h即可见低密度紫色膜状物形成,4d左右形成致密稳定的生物膜。(2)MIC:美罗培南64μg/ml、头孢哌酮钠256μg/ml、头孢哌酮/舒巴坦钠256μg/ml、舒巴坦32μg/ml及IDR-1018 32μg/ml。(3)部分抑菌浓度指数(FICI):IDR-1018联合美罗培南为1.25,两者联用对AB的联合药敏结果为无关作用;IDR-1018联合舒巴坦为1.5,两者联用对AB的联合药敏结果亦为无关作用。(4)细菌接种0h时予美罗培南、舒巴坦及IDR-1018单独或联合干预24h,浓度为64μg/ml的美罗培南或32μg/ml的舒巴坦只能抑制浮游菌生长,而对生物膜没有明显抑制作用;32μg/ml的IDR-1018抑制浮游菌生长同时可抑制47.8%AB生物膜的形成。16μg/ml的IDR-1018联合美罗培南(16μg/ml)或舒巴坦(8μg/ml)后,可完全抑制生物膜的形成。(5)细菌接种24h后予美罗培南、舒巴坦及IDR-1018单独或联合干预24h,单独应用三种抗菌制剂未见明显生物膜抑制作用,联合应用后,随着IDR-1018浓度逐渐降低,对生物膜状态的AB的抑制作用逐渐减弱。CLSM下可见美罗培南(64μg/ml)或舒巴坦(32μg/ml)单独作用后,生物膜内活/死菌比例较对照组无明显变化,联合IDR-1018(64μg/ml或32μg/ml)后,生物膜内活菌数量明显减少,以死菌为主。结论:(1)以PVC材料为粘附载体可成功构建AB生物膜模型。(2)体外实验证实IDR-1018分别与美罗培南或舒巴坦联用,对AB的联合药敏结果均为无关作用。(3)生物膜是细菌产生耐药性的重要原因,美罗培南及舒巴坦浓度为MIC时,只能抑制浮游菌生长,而对生物膜状态的细菌效果较差。(4)细菌未形成生物膜时,予IDR-1018联合美罗培南或舒巴坦可有效抑制生物膜的形成。(5)生物膜形成初期(24h),予IDR-1018联合美罗培南或舒巴坦可以抑制生物膜的进一步成熟。
【图文】：

生长曲线,生长曲线,细菌繁殖

生理盐水冲洗 3 次，用 10μg/ml 的 PI 在 4℃冰箱中避光染色 15min，冲洗 3 次并吸干水分后 40%甘油封闭。2.7 统计分析采用 SPSS 19.0 统计软件对数据进行统计分析。经检验，实验数据符合正实验组与对照组生物膜结晶紫染色半定量检测结果采用单因素方差分析间生物膜结晶紫染色半定量检测结果采用正交试验方差分析。P<0.05 为统计学意义。结果1 ATCC BAA-1605 生长曲线如图 1 所示。细菌接种至 LB 培养基后，0～4h 为生长迟缓期，细菌繁殖h 开始进入对数生长期，，细菌以几何数级快速增长，菌液密度迅速增加，4h 左右；第 14h 后细菌进入稳定生长期，细菌繁殖速度渐趋下降。

形成曲线,生物膜,舒巴坦,头孢哌酮

图 2 ATCC BAA-1605 生物膜形成曲线细菌接种于 PVC 96 孔板后，24h 时即有生物膜形成，4d 左右达到成熟状态，并稳定存在3 抗菌肽及抗菌药物的 MIC微量肉汤稀释法测得抗菌肽及抗菌药物的 MIC 分别为美罗培南 64μg/ml、哌酮钠＞256μg/ml、头孢哌酮/舒巴坦钠＞256μg/ml、舒巴坦 32μg/ml 及 IDR-1μg/ml。单用舒巴坦时 MIC 仅为 32μg/ml，而以 2:1 比例配制头孢哌酮/舒巴坦其 MIC 未见下降反而较舒巴坦单用明显增加。因此，另做一组以同样比例配水/舒巴坦，并测得其 MIC 与头孢哌酮/舒巴坦钠相同，MIC＞256μg/ml。这说孢哌酮钠没有抑菌效果，其与舒巴坦联合应用后不发挥抗菌活性反而稀释了坦的浓度，使得其 MIC 显著增加。因此后续实验不再做头孢哌酮钠及头孢哌巴坦钠与抗菌肽 IDR-1018 的联合抑菌试验。4 IDR-1018 联合美罗培南或舒巴坦的抗菌作用
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R965

【参考文献】