α-DG糖基化及其调节在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为中的作用

发布时间：2020-04-02 17:27

【摘要】：第一部分α-DG糖基化在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为中的作用目的:α-肌营养不良聚糖(α-dystroglycan,α-DG)为抗肌萎缩蛋白相关复合体(dystrophin-glycoprotein complex,DGC)的核心组成部分,也为多种细胞外基质分子的高亲和力受体。α-DG前体蛋白分子量大小为72 kDa,中间区域结构含黏蛋白样结构域(mucin-like domain),翻译后主要经过糖基化修饰该结构域形成糖基化α-DG(glycosylated α-DG,GLY-α-DG),且在不同组织中α-DG的糖基基团所占比例不同,因此蛋白分子量差异较大,在骨骼肌、心肌和脑组织和周围神经中形成蛋白的分子量为156,140和120kDa。α-DG的N端可通过蛋白酶剪切形成分子量大小为39kDa的游离分子,简称α-DG-N,可分泌入脑脊液和血浆中。现有研究表明α-DG的低糖基化状态与疾病的发生密切相关,但主要集中于肌营养不良相关的疾病中,在抑郁症中的研究尚未报道。C57BL/10ScSn-Dmdmdx/J小鼠(X-连锁肌萎缩小鼠,mdx小鼠)为常用的研究杜氏肌营养不良的基因敲除鼠模型,尽管该模型鼠直接敲除的是DGC复合体中表达的分子肌萎缩蛋白(dystrophin),但大量研究表明其外周和脑组织中GLY-α-DG的表达显著下调,且该模型鼠表现出认知功能损伤和焦虑水平提高,近年来研究表明抑郁症患者(major depressive disorder,MDD)认知功能也存在缺陷,常伴随焦虑症状。提示可以选用mdx小鼠来研究GLY-α-DG与抑郁症发生的关系。本部分研究主要运用慢性社会挫败应激(chronic social defeat stress,CSDS)方法建立小鼠抑郁模型,检测与抑郁症发生密切相关的脑区中GLY-α-DG的蛋白表达水平,结合mdx小鼠行为学研究,探讨GLY-α-DG在CSDS诱导的小鼠抑郁样行为中的作用。方法:采用CSDS方法建立小鼠抑郁症模型;采用western blot方法检测CSDS敏感鼠和抵抗鼠中α-DG蛋白在抑郁症相关脑区的变化,包括前额叶皮层(prefrontal cortex,PFC),尾壳核(caudate putamen,CPu),伏隔核(nucleus accumbens,NAc),海马(hippocampus,Hip),缰核(habenular nuclei,Hb),外侧杏仁核(lateral amygdala,LA)和中央杏仁核(central amygdala,CeA);进一步细分海马为背侧海马(dorsal hippocampus,dHip)和腹侧海马(ventral hippocampus,vHip),采用 western blot 方法检测背侧海马和腹侧海马α-DG的蛋白表达变化;采用免疫荧光方法检测α-DG在腹侧海马各个亚区的表达(CA1,CA3和DG);采用western blot方法检测腹侧海马糖基化α-DG(GLY-α-DG)的蛋白表达变化;免疫荧光方法验证mdx小鼠的基因敲除效果,western blot方法检测mdx小鼠中GLY-α-DG的蛋白表达水平;检测mdx小鼠抑郁、焦虑相关行为学;亚应激检测mdx小鼠对应激的易感性;构建α-DG编码基因DAG1的沉默病毒si-DAG1,验证其沉默效果,然后检测腹侧海马脑区注射si-DAG1对小鼠应激易感性的影响。结果:(1)经过为期十天的CSDS后,行为学检测发现CSDS敏感鼠表现出抑郁样行为,社会接触比值降低(control:1.57±0.17,n = 22;susceptible:0.51 ±0.06,n = 30,p0.01 vs control),糖水偏好率降低(control:0.88 ±0.01,n = 22;susceptible:0.48± 0.03,n = 30,p0.01 vs control);CSDS抵抗小鼠的社会接触比值和糖水偏好率分别为1.46±0.07和0.84±0.03(n = 21),同对照相比无明显差异。(2)检测各脑区α-DG的蛋白表达,结果发现在CSDS敏感鼠中,仅海马脑区α-DG的蛋白表达显著下降(control:1.00 ± 0.03;susceptible:0.69 ± 0.08,n = 12-13 mice/group,p0.01 vs control),而CSDS抵抗鼠中α-DG的蛋白表达在各脑区无明显差异。(3)细分海马为背侧和腹侧亚区,发现这种降低趋势主要出现在腹侧海马(control:0.99 ± 0.02;susceptible:0.79 ± 0.03,n = 11-13 mice/group,p0.05 vs control),背侧海马则无明显变化(control:0.90 ±0.03,susceptible:0.99 ±0.03,n = 8-9 mice/group)。进一步用免疫荧光方法进行检测,也得出相同的结论。(4)腹侧海马中GLY-α-DG表达也显著降低(control:1.00 ±0.03;susceptible:0.80 ±0.04,n= 11-12 mice/group,p0.05 vs control)。(5)免疫荧光结果表明mdx小鼠中dystrophin长链分子完全敲除,基因敲除鼠构建成功。Mdx 小鼠 GLY-α-DG 表达降低(WT:1.00 ±0.03;susceptible:0.77±0.04,n = 4mice/group,p0.01vsWT),尼氏染色中尼氏小体数目减少。(6)Mdx小鼠表现出高水平的焦虑行为,在旷场行为学检测中总运动距离减少(WT:3757.00±231.10 cm,n= 10;mdx:2855.00 ± 196.70 cm,n= 18,p0.05 vsWT),中央区运动距离、中央区停留时间(center distance:481.40 ±62.88 cm;center time:54.01 ±7.08 s,n = 18)均较野生型小鼠(center distance:748.90±95.97 cm;center time:78.86±8.43 s,n= 10,p0.05 vs WT)显著降低,平均运动速度低于野生型小鼠(WT:7.88± 0.24 cm/s,n= 10;mdx:7.01 ±0.19 cm/s,n= 18,p0.0lvsWT)。高架十字迷宫行为学检测中,mdx小鼠在开放臂停留时间较野生型小鼠显著性减少(WT:83.39 ±9.10 s,n= 10;mdx:29.75 ± 5.88 s,n= 18,p0.01 vs WT),在闭合臂中停留时间显著增加(WT:175.80 ±10.31 s,n= 10;mdx:227.40 ± 9.94 s,n= 16,p0.01 vs WT),mdx小鼠运动距离较野生型小鼠增加(WT:971.70 ±73.03 cm,n= 10;mdx:1182.00±61.68 cm,n=16,p0.05vs WT)。(7)Mdx小鼠表现出部分抑郁样行为,摄食潜伏期延长(WT:166.80 ±34.14 s,n= 10;mdx:336.20 ±41.60 s,n= 19,p0.05vsWT),在 FST(WT:90.78±11.17s,n = 9;mdx:131.60±11.27s,n=19,p0.05 vs WT)和 TST(WT:88.80 ±13.44 s,n= 10;mdx:122.40 ± 6.18 s,n=12,p0.05 vs WT)中不动时间延长,在新事物认知功能检测中认知功能降低(discrimination index:WT:0.66 ±0.03,n = 9;mdx:0.52 ±0.02,n= 19,p0.01 vs WT),但不影响糖水偏好和饮水量。经过阈下社会挫败应激后,mdx小鼠应激易感性增强,表现出社交逃避行为(WT:1.861 ±0.1775,n = 7;mdx:0.91 ±0.27,n = 8,p0.05vs WT),糖水偏好率也显著降低(WT:0.75±0.04,n = 8;mdx:0.50±0.07,n = 9,p0.05 vs WT)。(8)GLY-α-DG 的沉默病毒 si-DAGl 降低 GLY-α-DG 的表达(si-GFP:1.01±0.01,n=16;si-DAGl:0.80±0.02,n=16,p0.01vssi-GFP)。(9)正常鼠沉默GLY-α-DG后进行阈下社会挫败应激,其社会接触比值降低(si-GFP:1.61± 0.10;si-DAGl:1.18 ± 0.12,n = 31-32 mice/group,p0.01 vs si-GFP),在 FST(si-GFP:41.29 ± 3.81 s;si-DAGl:71.72 ± 5.40 s,n = 31-32 mice/group,p0.01 vs si-GFP)和 TST(si-GFP:131.60±7.24s;si-DAGl:167.40±6.81s,n = 31-32mice/group,p0.01 vssi-GFP)中的不动时间延长,糖水偏好率降低(si-GFP:0.72±0.03;si-DAG1:0.59 ± 0.04,n = 31-33 mice/group,p0.01 vs si-GFP)。结论:CSDS诱导出小鼠抑郁样行为,敏感鼠vHip脑区α-DG、糖基化α-DG(GLY-α-DG)的蛋白表达水平均降低。Mdx小鼠GLY-α-DG表达水平降低,焦虑水平升高,表现出部分抑郁样行为,且应激易感性增加。腹侧海马脑区给予慢病毒沉默GLY-α-DG增加小鼠的应激易感性。第二部分调节α-DG糖基化在慢性社会挫败应激所致小鼠抑郁样行为的作用目的:糖基化修饰后的α-DG(GLY-α-DG)作为细胞外基质的高亲和力,可与富含LG结构域(laminin globular domains)的分子结合相互作用,主要包括基底膜聚糖(perlecan)、聚集蛋白(agrin)、轴突蛋白(neurexin)等,在抑制性神经元中neurexin可与突触后表达的神经连接蛋白(neuroligin)和神经外营养蛋白(neurexophilins)相互作用,与α-DG的结合不具有特异性。关于perlecan的研究主要集中于外周及脑血管中。近期研究表明agrin可表达于培养的海马神经元和星形胶质细胞中,且在神经元中的含量为星型胶质细胞含量的千倍,表明脑组织中agrin主要来源于神经元。以往对agrin的研究主要集中于培养的神经元中,而在脑组织中的研究甚少。本实验拟通过正常鼠给药筛选agrin产生抗抑郁作用的浓度,并研究agrin在CSDS敏感鼠中的作用。乙酰氨基葡萄糖转移酶样蛋白(like-acetyl-glucosaminyltransferase,Large)为α-DG糖基化主要的酶,本实验检测抑郁模型小鼠中Large的表达变化,并通过腺相关病毒调控Large的表达,研究其对抑郁样行为的影响。另外,GLY-α-DG参与稳态突触可塑性的调节,GLY-α-DG可抑制GABA能神经元受体的膜转运,过表达LARGE可增强抑制性突触的强度,增加GABAA受体膜表达。已有研究表明海马脑区GABA能神经元的活性降低,抑制性神经递质GABA合成酶如GAD65、GAD67表达降低,GABA递质释放减少,抑制性突触传递受损。基于此,我们进一步通过电生理研究过表达Large对CSDS敏感鼠抑制性突触传递的影响,阐明GLY-α-DG介导CSDS所致小鼠抑郁样行为的机制。方法:正常小鼠腹侧海马脑区置管进行剂量筛选,脑区定位注射给予agrin,分别在给药1d和3d后进行行为学检测;CSDS敏感鼠腹侧海马置管,连续给予agrin 3d后,分别在给药结束后1 d、1 w、2 w检测抑郁相关行为学;用共聚焦荧光拍摄、western blot和qPCR方法验证AAV-Large病毒效果;腹侧海马脑区注射该病毒后检测行为学;采用脑片膜片钳方法记录腹侧海马CA1区微小抑制性突触后电流(miniature inhibitory postsynaptic current,mIPSC)。结果:(1)在正常小鼠中,腹侧海马单次给予agrin后不影响TST的不动时间;连续给药3 d后低、中浓度组的agrin均显著减少TST不动时间,高浓度组则无明显作用(vehicle:156.70 ± 18.51 s;10 μg/ml:87.06 ± 13.97 s;20 μg/ml:88.83 ± 21.90 s;40μg/ml:112.30±25.34 s,n = 5-7mice/group,p0.05vsvehicle)。(2)在 CSDS 敏感鼠中,腹侧海马脑区连续给予agrin 3 d,在给药后1 d,TST不动时间显著降低(CSDS:160.70±9.27s;1d:129.10±13.53s,n = 5-15mice/group,p0.05vsCSDS),在给药后lw和2 w无明显差异。在FST检测中,与给药前相比,给药后1d和给药后1 w 不动时间均显著降低(CSDS:59.83 ± 7.170 s;1d:36.08 ± 7.70 s;1w:19.00 ±6.95 s,n = 5-15mice/group,p0.05vsCSDS),但在给药后 2w 无明显差异。(3)在 CSDS敏感鼠中检测主要的糖基化酶Large的蛋白水平,其在CSDS敏感鼠中表达显著降低(control:1.00 ± 0.02;susceptible:0.85 ± 0.05;n = 10,p 0.05 vs control)。(4)构建过表达Large的腺相关病毒AAV-Large,可显著增加Large的蛋白表达水平(AAV-GFP:1.00 ±0.05,n = 4;AAV-Large:1.72 ±0.12,n = 7,p0.01 vsAAV-GFP)和 α-DG 的糖基化水平(AAV-GFP:1.00 ±0.01,n = 6;AAV-Large:1.12 ±0.05,n =6)。(5)在CSDS敏感鼠腹侧海马中注射AAV-Large过表达病毒,其降低TST(control+ AAV-GFP:142.20 ± 8.13 s;control + AAV-Large:155.60 ± 7.43 s;susceptible +AAV-GFP:170.60 ± 6.50 s;susceptible + AAV-Large:141.50 ± 6.46 s)和 TST(control+ AAV-GFP:31.41 ± 6.14 s;control + AAV-Large:36.64 ± 10.22 s;susceptible+AAV-GFP:59.95 ± 6.15 s;susceptible + AAV-Large:34.06 ± 7.27 s)的不动时间,减轻CSDS敏感鼠的社会逃避行为,表现为社会接触比值降低(control+AAV-GFP:1.39± 0.29;control + AAV-Large:1.17 ± 0.15;susceptible +AAV-GFP:0.61 ± 0.06;susceptible+ AAV-Large:1.60 ± 0.50;n = 10-20 mice/group;p 0.05,p0.01 vs control +AAV-GFP,p0.05,p0.01 vs susceptible + AAV-GFP)。AAV-GFP 则无上述效果。(6)腹侧海马过表达Large阻断CSDS敏感鼠mIPSC频率(control + AAV-GFP:5.01± 0.36 Hz;control +AAV-Large:4.48 ± 0.64 Hz;susceptible +AAV-GFP:3.34 ± 0.37 Hz;susceptible +AAV-Large:5.71 ± 0.37 Hz,n = 5-10 cells from 3-5 mice per group,p0.01 vs control + AAV-GFP,p0.01 vs susceptible + AAV-GFP)和幅度的降低(control +AAV-GFP:11.21 ± 0.29 pA;control + AAV-Large:8.65 ± 0.44 pA;susceptible +AAV-GFP:9.52 ± 0.29 pA;susceptible + AAV-Large:11.24 ± 0.42 pA,n = 5-10 cells from 3-5 mice per group,p0.01 vs control + AAV-GFP,p0.01 vs susceptible + AAV-GFP)。结论:正常小鼠腹侧海马脑区定位给药3天,低、中浓度agrin减少TST不动时间。抑郁模型鼠给予中浓度agrin 3天后产生抗抑郁作用,部分行为学改善作用可维持1 w左右,给药2 w后检测无抗抑郁作用。应激敏感鼠腹侧海马中Large蛋白表达水平降低,在该脑区定位注射过表达LARGE的AAV病毒,可改善CSDS敏感鼠的抑郁样行为,同时拮抗mIPSC频率和幅度的降低。
【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R749.4

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