伊曲康唑对巨噬细胞极化和吞噬白念珠菌能力的影响的研究

发布时间：2020-04-05 03:37

【摘要】：目的:探讨伊曲康唑(Itraconazole,ITZ)对巨噬细胞的极化及其吞噬白念珠菌(Candida albicans,C.albicans)能力的影响。方法:采用小鼠类巨噬细胞RAW264.7细胞系,实验组:0.25、0.5、1μM伊曲康唑和脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)、白细胞介素-4(Interleukin-4,IL-4)或紫外灭活C.albicans处理;对照组:加LPS、IL-4或C.albicans,不加伊曲康唑处理;阴性对照组:不加任何刺激,不加伊曲康唑处理。(1)不加伊曲康唑组作对照,用细胞计数试剂盒(Cell counting kit-8,CCK-8)检测0.0625、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16μM伊曲康唑在12、24、48 h时对RAW264.7细胞活力的影响;(2)紫外灭活C.albicans;(2)异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)染C.albicans,RAW264.7细胞:C.albicans比例为1:4和1:8时,流式细胞仪(Flow cytometry,FCM)定量检测实验组与对照组巨噬细胞吞噬白念珠菌能力的差异;(3)红色荧光细胞链接试剂盒(PKH 26)染RAW264.7细胞膜,FITC染C.albicans,共聚焦激光扫描显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)定性检测伊曲康唑对RAW264.7细胞吞噬紫外灭活的酵母相C.albicans的影响;(4)流式细胞微球芯片捕获技术(Cytometric beads array,CBA)或液相芯片分析技术(Luminex)检测LPS、IL-4和紫外灭活C.albicans诱导的RAW264.7细胞在不同浓度伊曲康唑作用下细胞因子的分泌;(5)免疫印迹试验(Western blot)检测LPS、IL-4和紫外灭活C.albicans诱导的RAW264.7细胞在不同浓度伊曲康唑作用下诱导型一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase,i NOS)和精氨酸酶-1(Arginase-1,Arg-1)的表达。结果:(1)与对照组相比,伊曲康唑对巨噬细胞的毒性具有浓度和时间依赖:在伊曲康唑浓度1μM作用12 h时,对RAW264.7细胞无明显细胞毒性;而在浓度2μM12 h显示出约14.57±6.96%的抑制作用和1μM 24 h显示出53.61±1.19%的抑制,在1μM处理48 h和2μM处理48 h后,抑制效果达90%以上,故0.25、0.5、1μM,12 h被选为后续实验条件;(2)FCM定量检测0.5和1μM伊曲康唑均显著增强了巨噬细胞吞噬白念珠菌(P0.05);(3)CLSM观察发现伊曲康唑显著增强了RAW264.7细胞吞噬酵母相C.albicans的能力;(4)伊曲康唑增强了LPS诱导的RAW264.7细胞白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)的分泌。(5)在IL-4诱导RAW264.7细胞中,伊曲康唑提高了IL-6、TNF-α、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的分泌,同时降低了白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)的分泌。(6)伊曲康唑增强了白念珠菌刺激RAW264.7细胞IL-6和TNF-α的分泌,而抑制了IL-4和IL-10的分泌。(7)Western blot结果显示,在三种不同刺激下,伊曲康唑均增强了i NOS的表达,并适度抑制Arg-1表达。结论:高浓度伊曲康唑(≥2μM)对巨噬细胞具有毒性效应;伊曲康唑可促进巨噬细胞吞噬;促进LPS、IL-4、C.albicans诱导下巨噬细胞促炎症因子如IL-6、TNF-α的分泌,抑制IL-4、IL-10的分泌,促使巨噬细胞向经典激活的巨噬细胞(Classically activated macrophage,M1)型的转化。伊曲康唑不仅有抗念珠菌作用,还有免疫激活效能,能够通过抑菌与免疫激活的双重作用促进真菌的清除。伊曲康唑提高RAW264.7的M1极化并增强了其吞噬作用,显示了其在临床新的应用潜力。
【图文】：

图 1A. RAW264.7 细胞镜下呈圆形，贴壁生长（200×）图 1B.流式细胞仪检测 F4/80+细胞高于 95%2 伊曲康唑对 RAW264.7 细胞的毒性作用呈剂量和时间依赖如图 2 所示，伊曲康唑对细胞生长的抑制作用呈明显的时间和剂量依赖。在伊

图 1A. RAW264.7 细胞镜下呈圆形，贴壁生长（200×）图 1B.流式细胞仪检测 F4/80+细胞高于 95%2 伊曲康唑对 RAW264.7 细胞的毒性作用呈剂量和时间依赖如图 2 所示，，伊曲康唑对细胞生长的抑制作用呈明显的时间和剂量依赖。在伊
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R96

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本文编号：2614480