电化学生物传感器的构建及其在间接毒性监测方面的应用

发布时间：2020-04-06 05:44

【摘要】：化学品使用日趋广泛,传统化学品毒性评价方法已无法满足有害化学物质暴露急剧增加及大量新化合物的评价需求。作为传统实验动物可替代的评价方法,体外活体细胞模型可以高灵敏地感知细胞外界环境的变化,并且通过多种细胞参数变化直接反映出来。故利用细胞在化学品、药品、环境毒素等外界刺激下,相应的代谢、阻抗等细胞生理参数的变化,可以间接监测毒性大小。本论文以微流控技术和电化学生物传感技术为基础,构建了化学品间接毒性监测平台,可用于化学品暴露的高效毒性预警和评价,以及加快新药研发过程中药物毒副作用及机理的研究进程。主要工作如下:平台理论及设计部分,重点介绍了化学品间接毒性监测平台中所涉及的细胞阻抗、细胞培养、细胞代谢、微流控系统等基本原理,确定了化学品间接毒性监测平台中两个核心传感芯片即生物反应器和细胞代谢监测芯片的结构,其中两个芯片之间由微通道和外部管道连接,并用微注射泵系统控制。生物反应器为可拆卸设计,能实现细胞培养,保证快速、简便、实时细胞阻抗监测,同时方便重复使用过程中芯片的清洗等操作。该反应器由透明或半透明材料制成,方便光学显微镜对细胞的生长状态的观察。细胞代谢监测芯片,为三明治可拆卸结构,其中检测电极为葡萄糖氧化酶和乳酸氧化酶修饰的丝网印刷电极,用于细胞外环境中葡萄糖和乳酸同时在线含量检测。平台制作及测试部分,基于以上设计方案,采用计算机辅助设计(Computer-aided design,CAD)制图软件设计芯片,使用溅射、光刻、计算机数字控制(Computer numerical control,CNC)等微加工工艺对其进行制作,并对所制备的芯片进行形貌和性能的考察。生物反应器主要包括:聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane,PDMS)细胞培养腔、叉指电极层和聚甲基丙烯酸甲酯(Polymethyl methacrylate,PMMA)夹具。叉指电极层中电极条完整,电极宽度为15μm和电极间距为30μm。细胞培养腔与叉指电极层进行生物相容性封装,无死腔。细胞代谢监测芯片包括:PMMA夹具、PDMS通道层和丝网印刷电极。所制备电极的葡萄糖检测范围为0~25 m M,乳酸检测范围为0~20 mM。样品测量前通过微流控系统自动进行标准液校准、空气吹扫、PBS稳定,整个循环为10 min。化学品间接毒性监测平台细胞阻抗采样间隔为10 s,细胞代谢监测采样间隔为10 min。实验分析部分,基于所构建的化学品间接毒性监测平台,考察了Hep G2细胞生长过程中的细胞阻抗,细胞代谢随时间的变化。结合细胞阻抗和细胞代谢过程中葡萄糖摄取率和乳酸产生率三种参数评价了D-山梨醇、对乙酰氨基酚、环磷酰胺、胺碘酮和鱼藤酮对HepG2细胞毒性,验证了平台间接评价化学品毒性可行性,并提出了相应的风险评估策略。此外,通过监测多种细胞参数,能更好地解释和区分不同化学品对细胞作用的机理。本研究所构建的间接毒性监测平台有望应用于细胞代谢生理学、线粒体呼吸功能测定、细胞培养条件优化等生物医药领域,为相关化学品和生态风险评估体系的建立提供了方法依据,在生命健康安全、生态文明建设等方面有着深远的意义。
【图文】：

生物传感器,结构示意图

图 1-1. 生物传感器结构示意图Figure 1-1. Schematic diagram of biosensor structure1.3.1 电化学酶传感器以酶作为分子识别元件的酶传感器，是最早研发的一种生物传感器，也是现在应用最广泛的商用传感器[50]。将酶固定在电极表面，再通过酶的催化作用，与生物分子发生化学反应，在信号转换器的作用下通过记录酶促反应产物的电化学变化，达到间接测定分析物的目的[51]。酶生物传感器发展经历了三个重要的阶：第一个阶段是以氧为中继体的电催化，通过测量反应物O2的减少或反应产物H2O2的产生量来实现分析物的测定；第二个阶段是利用具有较低氧化电位的传递介体在电极上产生的氧化电流，能够避免其他电活性物质的干扰，提高测定的灵敏度和准确性；第三阶段是利用酶与电极之间的直接电子传递，选择合适的交联剂，将酶共价修饰到电极上，使酶氧化还原活性中心与电极接近，能够相对容易地直接进行电子传递。本文后续细胞代谢的监测中，采用电化学酶传感器，故在本文的第二章对其原理进行了详细的阐述。1.3.2 电化学免疫传感器电化学免疫传感器利用抗体对特定化合物或抗原具有特异亲和力，通过结合后所产生的电信号变化对目标检测物进行定量[52]。电化学免疫传具有操作简单、快速、灵敏、

示意图,细胞,阻抗,电极

2.1.1 细胞阻抗传感器细胞阻抗传感器（Electric Cell-substrate Impedance Sensor, ECIS）是指体外环境下，通过对活体细胞的阻抗进行非侵入性监测，从而对细胞粘附，扩散和运动进行分析，达到监测细胞生理变化的目的[77, 78]。在生长和繁殖之前，细胞需要在培养基底或表面进行黏附，形成黏着斑（Focal adhesion）。图 2-1 显示了 Giaever 和 Keese 首次将平面电极通过测量阻抗来检测细胞形态变化的原理[79, 80]。将微电极构建在细胞附着平台下方，在电极上施加交流，如果电极表面没有细胞，电流可以在表面自由流动。然而当细胞生长在电极表面后，细胞会将阻碍电流，增加系统的电阻。这是因为完整的细胞膜是高度绝缘的，而当一些化学品或者药物作用于细胞时，细胞与电极之间的黏附率会受到影响，或者细胞本身受到损伤，细胞膜完整性受到影响，这些都会导致系统的阻抗改变。在直流或是低频交流时，电流更倾向于流经细胞与电极之间的间隙，，以及细胞与细胞之间的间隙，因此低频阻抗更能反映细胞与电极之间阻抗贴附的紧密程度，以及细胞之间的连接情况。在高频交流情况下，电流开始穿透细胞膜，流经细胞质从而反映细胞膜完整性和细胞生理状态信息[71]，并且这种施加信号是对细胞无损的，可以用于长时间细胞的监测[81]。
【学位授予单位】：石河子大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：TP212;R99

【参考文献】