三七内生真菌Penicillium janthinellum及次级代谢产物的研究

发布时间：2020-04-08 06:05

【摘要】：植物内生真菌与宿主之间长期互生共存,使得它们之间的关系变得十分复杂。同时,内生真菌可以产生大量的次级代谢产物,具有抗肿瘤、抗菌、抗病毒等活性,因此,植物内生菌作为天然药物的资源宝库值得不断探索。本论文以一株分离自健康三七根部的青霉属真菌Penicillium janthinellum SYPF 7899为研究对象,综合运用硅胶柱色谱、ODS柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱、反相半制备HPLC等色谱学分离手段对其固体发酵产物中的次级代谢物进行了研究,共得到32个单体化合物。根据理化性质、波谱数据(UV、IR、MS、1H-NMR、13C-NMR 和 2D-NMR)、计算 ECD、化学衍生化(Mosher)等方法鉴定化合物的平面结构及立体结构,分别为:brefeldin El(1),brefeldin E2(2),brefeldin E3(3),brefeldin E4(4),brefeldin E5(5),brefeldin A(6),brefeldin A 7-0-acetate(7),altemariol-5-O-methyl ether(8),3'-hydroxyalternariol-5-O-methyl ether(9),mangrovamides A(10),brasiliamide J-a(11),brasiliamide J-b(12),peniciolidone(13),dehydroaustinol(14),dehydroaustin(15),7-hydroxydehydroaustin(16),1,2-dihydro-acetoxydehydroaustin(17),austinol(18),austin(19),5R-isoaustinone(20),l1β-acetoxyisoaustinone(21),4-toluene-1,3-dicarbamic acid dimethyl ester(22),glicoricone(23),striatisporolide A-l1-formylation(24),4-hydroxy-benzaldehyde(25),orcinol(26),penicillic acid-a(27),furanone glucoside(28),penicillic acid-b(29),5-hydroxy-3-isopropyl-4-methoxyfuranone(30),(2S,3R)-2,3-epoxyhexanoic acid(31),methyl 2-(2-acetyl-3-hydroxy-5-methoxyphenyl)acetate(32)。其中1-5,11-13为新化合物,其余为已知化合物。对分离到的所有化合物进行活性研究,发现部分化合物具有较强抗菌、抗肿瘤和抗病毒活性。其中化合物6-7对六株人类致病菌,包括蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、大肠埃希氏菌(Escherichia olli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)具有较强的抑制作用。化合物6的最小抑菌浓度(MIC)分别为20、25、22、35、36和28μg/mL;化合物7的MIC分别为21、28、22、38、39和31 μg/mL;化合物11-12对革兰氏阳性细菌B.cereus、B.subtilis和S.aureus有明显的抑菌效果,化合物11的MIC分别为25、18和18 μg/mL;化合物12的MIC分别为21、15和18μg/mL。通过观察菌体形态,发现化合物11和12作用后的B.subtilis菌体变长而不分裂、S.aureus菌体肿胀变大而不分裂。采用分子对接研究发现,化合物11和12能分别与负责细菌分裂的丝状温度敏感蛋白(filamentous temperature-sensitive protein Z,FtsZ)很好结合,且能量值均低于蛋白本身的共结晶小分子(ligand),表明化合物11和12很可能是通过与FtsZ蛋白结合导致细菌分裂受阻,最终细菌死亡。另一方面,化合物6和7亦显示出对肿瘤细胞HepG2,Huh7,KB和MDA-MB-231较强的细胞毒作用,其抑制活性(ID50)分别为分别为0.024、0.028、0.0625和0.064 μM及0.024、0.035、0.06和0.064μM,与阳性对照药物L-脱氧胞苷(LODDC)相似。以HepG2为研究对象,发现其抗肿瘤作用是通过抑制细胞分裂间期的S期,从而导致细胞生长受阻。此外,化合物6和7对丙型肝炎病毒(HCV)亦显示出较强的抑制活性,其ID50分别为0.022和0.013μM。内生真菌Pjanthinellum SYPF 7899及其代谢物对常见的三七致病菌Alternaria brassicicola、Cylindrocapon destructans和Fusarium solani有不同程度的抑制活性,其中化合物6和7的抑制作用较强(MIC30 μg/mL)。以菌株SYPF 7899制备的生物菌剂施用于云南三七大田后,发现其能显著降低根腐病发病率;提高植株的高度、茎鲜重、根鲜重、根干重;显著提高根尖防御酶(过氧化物酶,POD;超氧化物歧化酶,SOD;过氧化氢酶,CAT)的活性;提高三七根部皂苷含量;而且对三七根尖细胞无损害,充分显示其促生作用。使用农杆菌介导的转化法成功获得增强绿色萤光蛋白(Enhance Green Fluorescent Protein EGFP)基因标记的转化菌株SYPF 7899-egfp,并将该菌株回植到三七植株根际周围,定期追踪,发现其能成功定殖和存活在三七根际土中,证明P.janthinellum SYPF 7899对三七的益生作用与菌体定殖和繁殖、保护植物健康生长、促进药效物质产生有紧密关系,显示其作为生防菌剂的潜在价值。
【学位授予单位】：沈阳药科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R915
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本文编号：2618994