程序性坏死参与锰致神经元死亡机制的研究
发布时间：2020-04-10 06:47
【摘要】：锰是公认的急、慢性蓄积性神经毒素,锰中毒可产生类似于帕金森样中枢神经损伤的症状且脱毒后症状持续存在,原因在于锰在大脑聚积诱发特定区域的神经细胞死亡和功能丧失,进而使中枢神经发生退行性变。锰中毒诱发的神经细胞死亡方式包括凋亡、自噬及坏死三种形式,目前锰中毒的神经元死亡机制研究主要集中于神经元凋亡。近年的研究表明,细胞的坏死也具有细胞内特定的信号转导系统,与受体相互作用蛋白3(Receptor interacting protein 3,RIP3)密切相关,RIP3被认为是调节依赖于RIP1介导的细胞凋亡与坏死间发生转换的关键因子。这一RIP3和混合系列激酶样结构域蛋白((Mixed lineage kinase domain-like protein,MLKL)的顺序激活诱导的可调控性细胞死亡称为程序性坏死(Necroptosis)。我们前期的实验证实锰中毒可诱发神经元的坏死,坏死细胞的超微结构表现为趋向于凋亡细胞的形态特征,提示锰中毒诱导的神经元坏死可能具有程序性坏死的调节机制,而锰诱导的细胞坏死是否与Necroptosis有关,目前尚无报道。本研究拟通过体内、外实验,运用细胞凋亡Caspase抑制剂zVAD-fmk和程序性坏死信号通路的特异性阻滞剂necrostatin-1(Nec-1)、RNA干扰等研究策略,探讨RIP3介导的程序性坏死信号通路在锰致神经元死亡中的作用。方法(一)zVAD-fmk、Nec-1对染锰SK-N-SH细胞的影响(1)以400 uM MnCL_2.2H_2O建立SK-N-SH细胞染锰模型,然后应用不同浓度zVAD-fmk、Nec-1进行干预。取对数生长期SK-N-SH细胞进行干预,分为Control group、400μmol/L Mn、0.5μmol/L zVAD-fmk、2μmol/L zVAD-fmk、60μmol/L Nec-1、120μmol/L Nec-1、Mn+0.5μmol/L zVAD-fmk、Mn+2μmol/L z VAD-fmk、Mn+60μmol/L Nec-1、Mn+120μmol/L Nec-1共10组,通过观察细胞形态、MTT法及流式细胞术观察染锰与药物干预对SK-N-SH细胞存活、凋亡及坏死的影响;(2)取对数生长期细胞分成5组,分别为Control group、200μmol/L Mn、400μmol/L Mn、400μmol/L Mn+0.5μmol/L zVAD-fmk、400μmol/L Mn+120μmol/L Nec-1,通过Western blot检测RIP3的蛋白表达量变化、DCFH-DA探针检测各组细胞ROS的生成情况。(二)慢病毒介导RIP3 RNAi对染锰SK-N-SH细胞的影响(1)构建慢病毒介导的RIP3 RNAi SK-N-SH细胞株;(2)降低(Knock down,KD)SK-N-SH细胞的RIP3基因表达后,进行染锰实验,并进行Nec-1干预。具体分组为:空白SK-N-SH细胞组(Control group),SK-N-SH细胞染400μmol/L Mn组,RIP3 Scrambled细胞组(NC),RIP3 RNAi细胞组,RIP3 RNAi细胞+Mn组,RIP3 RNAi细胞+Mn+120μmol/L Nec-1组。通过MTT法、流式细胞术检测RIP3表达降低后染锰及Nec-1干预对SK-N-SH细胞存活、凋亡及坏死的影响;Western blot检测各组RIP3和磷酸化MLKL的蛋白表达变化。(三)Nec-1对亚急性锰暴露大鼠黑质和海马的影响(1)Sprague Dawley(SD)大鼠60只分为对照组、Nec-1对照组、锰中毒组和Nec-1干预锰中毒组。所有动物均先通过手术作侧脑室埋管,然后通过腹腔注射锰溶液建立亚急性锰中毒模型(15 mg/kg,5天/w,共4w),同时对药物干预组给予侧脑室内注射Nec-1(19.28 mmol/L,5μL/次,3次/w,共4w),染锰及干预结束后拔除侧脑室置管,连续饲养动物两周;(2)大鼠经灌注固定后,免疫组织化学法观察黑质酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)阳性细胞和海马CA1区胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)阳性细胞表达的变化,透射电镜观察海马神经元细胞的超微结构变化;(3)大鼠经颈椎脱臼法处死动物,取黑质组织,PCR荧光定量法检测RIP3、Bcl-2、Caspase3、NOX2和NOX4基因的表达。结果(一)程序性坏死抑制剂Nec-1可减少染锰SK-N-SH细胞的死亡(1)与对照组相比较,人SK-N-SH细胞染锰24h后,细胞胞体皱缩变圆、突起回缩变短、胞浆内可见大量泡l锤谋，
本文编号：2621892
本文编号：2621892
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yiyaoxuelunwen/2621892.html
最近更新
教材专著
