纳米双载药智能水凝胶的构建及在头颈部鳞癌光化联合治疗中的应用

发布时间：2020-04-13 07:27

【摘要】：背景:头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一,发病率和死亡率极高。这些肿瘤大多处于表浅或重要的解剖位置,而传统的治疗方式存在各自的局限性,所以目前亟需一种有效、微创、全身低毒的治疗方式。水凝胶以其优越的性能如微创、靶向、控释、易降解等受到了广泛关注。然而,将化疗药物和光敏剂共装载至水凝胶中的报道却很少。在本研究中,我们合成了一种纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称NDIMH),将化疗和光疗结合,以期为HNSCC提供一种新的治疗策略。第一部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应水凝胶的合成及表征首先合成基质金属蛋白酶响应水凝胶(简称MH),应用扫描电镜观察其形态、MTT法检测了细胞毒性及观察体内外降解情况;进一步应用溶剂-反溶剂法制备纳米阿霉素及纳米吲哚菁绿,并对纳米药物的稳定性、粒径分布、表面形态等进行表征;最后将纳米阿霉素及纳米吲哚菁绿装载至基质金属蛋白酶响应水凝胶内,合成纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称纳米双载药智能水凝胶),再次应用扫描电镜和体外药物释放试验对其进行表征,明确理化性质。同时制备了纳米阿霉素基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称NDMH)和纳米吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应性水凝胶(简称NIMH),以便后续研究。结果显示,MH在扫描电镜下疏松多孔,利于药物的装载,对细胞增殖无毒副作用,并具有良好的基质金属蛋白酶(MMPs)响应特性;制备的纳米药物稳定性良好,用透射电镜观察纳米颗粒表面光滑圆整、分布均匀。纳米阿霉素平均粒径为81 nm左右,纳米吲哚菁绿为109nm左右;纳米双载药智能水凝胶纳米药物在智能水凝胶中均匀分布,体内外药物释放实验显示,纳米双载药智能水凝胶在MMPs条件下能缓慢释放纳米药物,具有良好的MMPs响应特性。第二部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应水凝胶的光敏特性研究通过体内外光热实验、细胞内活性氧检测和体外细胞摄取实验评估纳米双载药智能水凝胶潜在的光疗特性。首先,利用红外热像仪监测激光照射下磷酸盐缓冲液、游离吲哚菁绿溶液、游离纳米吲哚菁绿溶液、纳米吲哚菁绿智能水凝胶和纳米双载药智能水凝胶体内外的温度变化,以评价其体外光热特性;然后检测了纳米吲哚菁绿智能水凝胶、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光、纳米双载药智能水凝胶+激光各组活性氧的产生情况;最后通过细胞摄取实验检测了纳米阿霉素智能水凝胶组和纳米双载药智能水凝胶+激光组(808 nm,0.5 W/cm2,8 minutes)阿霉素的摄取情况。体内外光热实验结果显示,在激光(808nm,1.0 W/cm2)照射下,纳米吲哚菁绿智能水凝胶和纳米双载药智能水凝胶升温最高,体内分别增加到了 63.2℃和65.6℃,体外为54.9℃和54.0℃,表明纳米双载药智能水凝胶具有良好的光热效能;活性氧实验结果显示,纳米吲哚菁绿智能水凝胶在808nm激光照射(0.5 W/cm2,8 minutes)后有较强的荧光,而纳米吲哚菁绿智能水凝胶组的荧光强度很弱或不存在,说明近红外照射是光敏剂产生单线态氧的先决条件。纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光组和纳米双载药智能水凝胶+激光组,荧光强度无差异,说明阿霉素并不能促进活性氧的产生;细胞摄取实验结果显示,纳米双载药智能水凝胶+激光组荧光信号要强于纳米阿霉素智能水凝胶组,说明激光照射可以促进细胞对阿霉素的吸收。第三部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋白酶响应水凝胶的体内外药效学研究以SCC-15为细胞模型,考察了纳米双载药智能水凝胶+激光(808 nm,0.5 W/cm2,8 minutes)的对细胞增殖、侵袭、转移的影响及MMP-2敏感性。MTT实验结果显示,纳米阿霉素智能水凝胶组、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光组及纳米双载药智能水凝胶+激光组对SCC-15的增殖侵袭均有不同程度的抑制作用,但纳米双载药智能水凝胶+激光组抑瘤效果最强,尤其是在MMP-2存在的前体下;Transwel实验及划痕实验结果提示,纳米双载药智能水凝胶在光照条件下,可抑制SCC-15的侵袭和转移。以SCC-15荷瘤裸鼠为动物模型,待瘤体长至150-200mm3时,瘤内注射给药,对比生理盐水组、纳米阿霉素智能水凝胶组、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光组、纳米双载药智能水凝胶+激光组裸鼠相对瘤体体积变化、考察各制剂的体内药效学性质。同时将各组肿瘤组织进行免疫组化,检测Ki67的表达和细胞凋亡情况,进一步评估各制剂的抗肿瘤效果。结果显示,体内药效学实验显示,与单一治疗组纳米阿霉素智能水凝胶、纳米吲哚菁绿智能水凝胶+激光相比,联合治疗组纳米双载药智能水凝胶+激光抑瘤效果最为明显。免疫组化结果显示,纳米双载药智能水凝胶+激光组Ki67表达量最少,细胞凋亡数最多,进一步证实了联合治疗比单一治疗抗肿瘤效果更强。综上说明在808nm激光照射下,纳米双载药智能水凝胶可以实现光化协同治疗,优化治疗效果。第四部分:纳米阿霉素-吲哚菁绿基质金属蛋蛋白酶响应水凝胶的体内安全性评价及代谢分布研究以SCC-15荷瘤裸鼠为动物模型,给予药物干预,分组同上。在整个实验期间,定期测量各组小鼠的体重变化。治疗结束后收集裸鼠的主要器官脑、心、肝、脾、肺、肾进行HE染色。数据显示,治疗期间小鼠体重无明显变化,主要器官HE染色结果未见异常。这些结果表明,所有的制剂均具有良好的生物安全性,局部控释给药可以实现靶向递送,大大降低药物的毒副作用。利用小动物活体荧光成像系统检测瘤内注射游离阿霉素+吲哚菁绿水溶液或纳米双载药智能水凝胶后,在特定时间点阿霉素和吲哚菁绿的荧光信号。168小时处死小鼠,采集小鼠的肿瘤及主要脏器进行体外荧光成像分析。结果显示,刚开始时阿霉素和吲哚菁绿主要聚集在肿瘤部位,游离组和凝胶组的荧光信号面积在24小时内逐渐变大。24小时后,游离组的荧光信号迅速下降,168小时几乎消失。与之相反的是,纳米双载药智能水凝胶组的荧光信号强度并没有明显下降,注射168小时后肿瘤部位依然可以检测到荧光信号;体外荧光成像结果显示,凝胶组的阿霉素和吲哚菁绿均分布在肿瘤部位和重要脏器中,其荧光信号强度远高于游离组。以上结果表明纳米双载药智能水凝胶具有良好的药物缓释性能,大大延长了阿霉素和吲哚菁绿在瘤内的滞留时间。在本研究中,我们结合靶向技术、纳米技术、光化联合治疗及荧光成像技术,成功地设计了一种新型的药物传递系统,即NDIMH,能够在肿瘤微环境中持续释放纳米阿霉素和纳米吲哚菁绿。通过物理化学表征、光敏实验及体内外药效学研究证实了抗肿瘤效果。据我们所知,这是首次将纳米阿霉素和纳米吲哚菁绿加载到对MMPs敏感的水凝胶中,用于治疗鳞癌(专利申请号:201810815535.2)。综上所述,我们开发了一种新型的药物传递系统,并证明瘤内注射纳米双载药智能水凝胶加以808nm近红外照射,或可作为治疗HNSCC的一种新策略。
【图文】：

光疗,肿瘤,微环境,肿瘤细胞

肿瘤微环境是由各种基质细胞和细胞外基质组成，具有低ｐＨ、低氧、高压等逡逑特点，并含有大量酶、生长因子等，调控着肿瘤细胞的生长、侵袭、转移等Ｐ邋１４１逡逑（图１）。传统的抗肿瘤方式大多以直接杀死肿瘤细胞为主，近年来，越来越多的逡逑研究专注于靶向肿瘤微环境，利用肿瘤特殊的微环境而设计的ｐＨ响应、酶响应型逡逑等载药系统层出不穷［｜４］。基质金属蛋白酶（ＭＭＰｓ）是一种细胞外基质蛋白酶，在逡逑许多实体瘤内都高表达。ＭＭＰｓ可以降解天然细胞外基质（ＥＣＭ）和基底膜，为逡逑肿瘤生长开辟更多的空间［１５＿｜７］。目前，以ＭＭＰｓ为靶点设计的新型载药系统日益逡逑增多，并取得了一定进展［１８］。逡逑树突状细胞逡逑／逦＾a苌慑义希惧鍄U逡逑ｗｍｒｎｍ邋／逦＼逦＾逦灥逡逑梊、＃！？a慑义献匀簧鄙讼赴卧洞ψ棋义贤迹敝琢鑫⒒肪持邢赴涞南嗷プ饔茫郏矗蒎义瞎饬埔云湮⒋础邢蛐院谩⒉涣挤从π　⒖芍馗粗瘟频扔攀疲谕肪辈繙W癌逡逑治疗中展现了广阔的应用前景［｜９＿２１］。肿瘤光疗包括光热治疗（ＰＴＴ）和光动力治疗逡逑（ＰＤＴ）。光热治疗指的是在激光照射下，通过激光产生的高热量来破坏消除肿瘤逡逑细胞。常用的激光有紫外光（ＵＶ）、可见光和近红外光。与紫外线／可见光相比

示意图,纳米药物,光动力治疗,肿瘤细胞

特定波长的光、光敏剂、活性氧是光动力治疗的三大基本要素。光动力治逡逑疗抗肿瘤机制（１）直接杀伤肿瘤细胞（２）损伤肿瘤血管（３）促进局部炎症（４）逡逑引发肿瘤免疫反应［２３］。在光照条件下，光热治疗通常与光动力疗法同时存在，光逡逑热治疗将光能转换成热能杀死肿瘤细胞；而光动力疗法中，光能将光敏剂激发产逡逑生活性氧（ＲＯＳ），从而诱发肿瘤细胞死亡［２４］。逡逑对于晚期肿瘤，单一手段往往不能完全杀死肿瘤细胞，达到良好的治疗效果。逡逑而光化联合治疗可以相辅相成，为恶性肿瘤提供新的治疗策略［５，，２５］。光疗可以辅助逡逑化疗，增强靶向特异性，并通过改变血管通透性介导药物更好的在肿瘤区富集（图逡逑２）；化疗可以辅助光疗，清除残余肿瘤细胞并抑制损伤血管的再生，有效抑制肿逡逑瘤复发（图３）。光化联合治疗可以增强抗肿瘤疗效并减少全身的毒副反应。此外，逡逑抗癌药物木身可能存在氧化应激，产生羟基自由基，当与光动力疗法结合时，这逡逑些自由基能够诱导癌细胞的细胞周期停滞，从而导致细胞毒性死亡［２６］。逡逑
【学位授予单位】：中国人民解放军医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R739.91;R943

【相似文献】