多肽-纳米金体系和多肽水凝胶体系的构建和抗癌性能研究

发布时间：2020-04-13 13:30

【摘要】：多肽作为一类优良的基因/药物载体,具有生物活性多样、免疫原性低、生物相容性好以及可控的自组装性能等多种优点,被广泛地应用于基因/药物的传输体系中,同时,一些从生物中提取出的特殊结构的多肽片段也可以作为治疗性分子,也逐渐应用于抗癌、抗菌等领域。将多肽作为基因或药物载体、或将其修饰在其他载体上,装载药物或基因形成纳米组装体,可以促进药物或基因的细胞内化,控制药物在肿瘤组织中的定点释放,提高基因转染效率,增强药物的治疗效果。近年来,利用多肽修饰介导的药物和基因的传递研究以及其在抗癌、抗菌等领域的研究备受专家学者关注。本论文从多肽的不同优势出发,研究了新型多肽在抗癌药物传输方面以及其作为治疗性分子在抗癌、抗菌领域的潜能。第一部分是多肽的制备、纯化和检测。采用标准Fmoc固相多肽合成(SPPS)技术,在2-氯-三苯甲基氯树脂固相反应器中,合成了实验中需要的七条多肽链:抗菌肽FIGAIARLLSKIF(Kn2)、FIKRIARLLRKIF(Kn2-7)、CKn2、CKn2-7、CKn2-RGDS(AP1)、CKn2-7-RGDS(AP2)、全保护多肽Nap-FFY(t-Bu)E(OtBu)-OH,并利用Bruker 400 MHz核磁共振和LCQ Advantage型电喷雾质谱仪对合成的各种多肽链进行表征。通过双电荷峰计算,实际的NLS分子量与计算出的理论值一致。并用高效液相色谱(HPLC)检测每条多肽链的纯度。第二部分在抗菌肽BmKn2及其突变体BmKn2-7的基础上,在多肽的N端添加一个半胱氨酸,并利用Au-S配位键,构建多肽修饰的纳米金颗粒(AuNP@Kn2和AuNP@Kn2-7)。基于实验设计,我们完成了Kn2、Kn2-7、CKn2、CKn2-7、CKn2-RGDS(AP1)、CKn2-7-RGDS(AP2)的设计和合成。我们利用柠檬酸钠法在可控状态下将氯金酸还原成粒径在约为18 nm的纳米金颗粒。并将源于蝎毒液的毒素多肽BmKn2-7修饰纳米金,并进一步研究其毒性,我们成功制备了多肽Kn2-7修饰的纳米金载体(AuNP@Kn2-7),粒径为34nm,相比较于多肽载体Kn2-7而言,具有较低的细胞毒性;另外,我们成功制备了Kn2-7-RGDS修饰的纳米金载体(AuNP@Kn2-7-RGDS),粒径为96 nm。经研究发现,Kn2-7-RGDS修饰的纳米金载体(AuNP@Kn2-7-RGDS)具有一定的肿瘤细胞抑制效果。第三部分制备含有多肽Nap-FFYE-CO-NH-(CH_2)_2-SS-MP抗肿瘤6-MP前体药物。由于该多肽片段Nap-FFYE-OH具有优良的自组装性能,通过透射电子显微镜(TEM)观测到,该6-MP前体药物Nap-FFYE-CO-NH-(CH_2)_2-SS-MP可以在中性水溶液中发生自组装,进而形成直径为50 nm左右的纳米纤维。体外药物释放实验结果显示,在不含谷胱甘肽(GSH)的条件下,6-MP前体药物中的6-MP没有显示出任何释放,但是在模拟肿瘤环境条件下,控制GSH浓度为40mM,二硫键发生断裂,体外释药曲线显示出明显的GSH敏感性,24 h后的累计药物释放效率几乎达到了75%。同时体外细胞毒性实验结果也证明,6-MP前体药物比游离的6-MP具有更低的细胞毒性。因此,这种含二硫键的还原敏感性6-MP前体药物,有望能够改善抗癌药物6-巯基嘌呤稳定性能差,细胞毒副作用大的缺陷,并且进一步实现肿瘤部位的响应性药物释放,使得抗肿瘤药物6-巯基嘌呤富集于肿瘤细胞,因而在癌症的临床治疗上有一定的应用潜能。
【图文】：

固相肽合成

图 1-1 固相肽合成（SPPS）[17]Fig. 1-1 Solid-phase peptide synthesis (SPPS).3 功能性多肽由于肿瘤细胞生长失去控制、基因异常表达等特点，因而肿瘤组织与织表现出非常不同的生理特性[18, 19]（如图 1-2）：①肿瘤细胞内还原物质远远高于正常细胞；②肿瘤细胞内和肿瘤细胞外均呈现出弱酸性环境；④胞内线粒体中的活性氧含量很高；④肿瘤细胞内和肿瘤细胞外很多酶均过；⑤肿瘤细胞质中含有大量的三磷酸腺苷等。考虑到上述肿瘤的特点，我计出针对于肿瘤组织的功能性药物载体，为了能够解决药物载体的靶向递内稳定转运、靶点定位释药、高渗透等难以解决的问题。在过去的二十年多的专家学者已经进行了大量的努力来研发新型靶向药物递送系统，因为靶向药物传递系统有望能够解决与当前临床实践相关的几个关键治疗问题

响应信号,肿瘤组织,肿瘤细胞,内存

内药物释放效率低下或者细胞内运输过程的效果较差。最终研究学者认识到许多治疗剂（例如抗癌药物、抗氧化剂、光敏剂等）和生物治疗剂（例如多肽、蛋白质药物、siRNA、DNA 等）只有被递送并释放到细胞区室中（例如细胞质或细胞、细胞核）才能够以发挥治疗作用[22, 23]。因此，潜在的靶向药物递送系统不仅应该能够克服细胞外屏障（例如长循环时间、与靶细胞的选择性结合、在患病部位的优先积累等），而且还应该能够同样克服细胞内屏障（例如细胞内化、内体逃逸、药物释放等）。在过去的几年中，设计新型生物响应纳米载体，响应细胞内信号，特别是酸性 pH 和氧化还原电位，释放药物，受到了极大的关注。pH敏感型纳米载体在低 pH 值情况下不稳定，通常在低至 5.5 和 4.5 的 pH 值的条件下释放药物，比如在在内体和/或溶酶体区室等低 pH 释放药物。相比之下，氧化还原响应载体主要用于在细胞质中分解和释放药物，其含有比细胞外液（约 2-20 μM）高 2 至 3 个数量级的谷胱甘肽（GSH）三肽（约 2-10 mM）（如图 1-3）[24]。
【学位授予单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943;R96

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