SMND克服GSH介导的铂类药物耐药性增强卡铂治疗效果的研究

发布时间：2020-04-22 20:01

【摘要】：前列腺癌(PCa)严重威胁人类健康,化疗在癌症治疗中非常重要,是目前临床PCa治疗不可或缺的手段。卡铂(CBP)为第二代二价铂Pt(Ⅱ)类抗癌药,对多种癌症均有很好的治疗效果,并被NCCN批准用于治疗前列腺癌。由于肿瘤代谢异常,肿瘤细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)浓度是正常细胞的7～10倍,肿瘤细胞内GSH浓度(2～20mmol/L)是肿瘤细胞外(2～20μmol/L)的1000倍左右。GSH的巯基基团与Pt(Ⅱ)亲和力很高,会竞争性结合Pt(Ⅱ),减少Pt(Ⅱ)与DNA结合,从而降低了 Pt(Ⅱ)的抗肿瘤活性。针对GSH介导的铂类药物耐药性,其解决措施主要包括以下三种:1)将Pt(Ⅱ)设计为还原敏感的四价铂Pt(Ⅳ),竞争性消耗GSH;2)应用GSH抑制剂,抑制GSH的合成;3)应用谷胱甘肽S转移酶(GST)抑制剂,抑制GSH与Pt(Ⅱ)的结合。Pt(Ⅳ)由于易于功能化修饰、具有高效的还原敏感性而备受关注。然而,Pt(Ⅳ)面临着体内分布缺乏选择性,毒副作用严重等问题。如何使Pt(Ⅳ)有效蓄积于肿瘤部位,竞争性消耗肿瘤细胞内的GSH,释放出活性Pt(Ⅱ),发挥Pt(Ⅱ)高效抗肿瘤作用仍然是铂类药物面临的重大挑战。纳米药物在药物递送领域展现了广阔的应用前景,为癌症治疗带来了希望。其中,小分子纳米药物(SMND)作为一种高性能的纳米药物引起了人们广泛关注。SMND是指低分子量的药物或药物衍生物在水溶液中自发组装形成稳定的超分子纳米聚集体。SMND在诸多方面展现了独特的优势:(1)可自发组装形成热力学稳定态的纳米粒子;(2)纳米粒由药物或其衍生物组成,无需或几乎没有辅料参与,载药量高,同时避免了大分子材料引入造成的代谢问题和毒副作用;(3)化学结构和制剂组分确定;(4)保留传统纳米药物的优势,如提高药物在肿瘤部位的蓄积,增强抗肿瘤效果,降低毒副作用。基于SMND理念,本课题设计了基于四价卡铂(CBP(ⅣV))的小分子纳米药物。首先将卡铂(CBP)氧化得到四价的羟基化卡铂(CBP-OH(ⅣV)),并将其作为极性部分,与生物相容性良好的非极性部分月桂酸,通过酯键共价连接得到类磷脂的两亲性缀合物CBP-LA;CBP-LA可在水溶液中自发组装形成稳定、的四价卡铂小分子纳米药物CBP-LANPs;CBP-LANPs可有效的蓄积于肿瘤部位,被肿瘤细胞摄取后,竞争性地消耗GSH,保护CBP免于GSH的鳌和作用,增强CBP与DNA的结合作用,最终提高抗肿瘤效果。本课题主要研究内容及结果如下:1 两亲性缀合物卡铂—月桂酸的合成及含量测定方法的建立首先合成两亲性的CBP-LA缀合物,核磁共振氢谱(1H nuclear magnetic resonance,1H-NMR)和高分辨质谱验证其结构。使用高效液相色谱法建立CBP-LA含量测定方法,并对其进行方法学考察。结果表明CBP-LA缀合物成功合成,CBP-LA在50～1250 μg/mL浓度范围内线性良好(R=0.9996)。CBP-LA在低、中、高浓度的日内、日间精密度RSD均小于2%,方法回收率在98%～102%之间且RSD小于2%,符合方法学含量测定要求。2 小分子纳米药物CBP-LA NPs的制备及体外评价通过纳米沉淀法制备小分子纳米药物CBP-LA NPs,考察了其形态、粒径、电位、血浆稳定性,临界胶束浓度等理化性质。结果表明,两亲性缀合物CBP-LA可自组装形成稳定的纳米药物(CBP-LA NPs),其粒径为(72.0±2.41)nm,电位为-(27.1±1.42)mV。血浆稳定性实验表明,CBP-LANPs与血浆孵育后,可在24 h内保持粒径稳定;较低的CAC对于维持制剂的稳定至关重要,CBP-LA NPs的CAC值为1.4 μg/mL,表明其具有良好的稳定性。通过HPLC对CBP-LA的GSH敏感性降解进行了评价。缀合物CBP-LA的GSH降解实验表明,无论pH是7.4还是6.5,CBP-LA缀合物在GSH环境下的降解速率均高于无GSH环境下的降解速率,且在微酸性环境(pH 6.5)下的降解速率高于pH 7.4时的降解速率。这是由于CBP-LA可在GSH条件下被还原,在酸性条件下发生酯键断裂,从而释放出活性Pt(Ⅱ)。这对于实现药物在肿瘤部位释放具有重要意义。通过测定肿瘤细胞内GSH的浓度和Pt(Ⅱ)与DNA结合率考察了CBP-LANPs克服GSH介导的铂类药物耐药性的能力,与CBP溶液组相比,CBP-LA NPs组消耗GSH的能力和与DNA鳌和产生Pt-DNA的能力均显著性提高。这是由于在肿瘤细胞高浓度的GSH条件下,CBP-LA NPs可被GSH还原,从而保护Pt(Ⅱ)不被GSH鳌和,提高Pt与DNA鳌和的能力。通过MTT实验评价了CBP-LA NPs的细胞毒性。体外细胞毒性评价实验中,CBP-LA NPs与游离CBP溶液的IC50值相当,表明CBP-LA NPs可有效抑制PC3细胞和RM-1细胞增殖,与CBP溶液组具有相当的杀伤能力。以C6作为荧光探针,通过倒置荧光显微镜及流式细胞仪考察了CBP-LA NPs的细胞内摄取,结果表明CBP-LA NPs具有良好的入胞效果。3 小分子纳米药物CBP-LA NPs的体内评价建立荷H22肿瘤细胞的小鼠模型,通过近红外小动物活体成像系统,考察了 CBP-LA NPs在小鼠体内组织的分布情况。结果表明,与游离的制剂相比,CBP-LA NPs能够增加药物在肿瘤部位的蓄积,减少其它正常组织的分布。以荷RM-1肿瘤细胞的C57BL/6小鼠作为前列腺癌模型对各药物体内抗肿瘤能力进行评价。结果表明,CBP-LANPs小鼠瘤体积及瘤重均低于CBP溶液组(P0.05),表现出最佳的抗肿瘤效果。这主要归因于CBP-LA NPs的特异性肿瘤蓄积作用及对GSH相关耐药性的克服作用。CBP-LANPs能够有效的蓄积于肿瘤部位,到达肿瘤细胞后可竞争性消耗GSH并释放出活性Pt(Ⅱ),提高Pt(Ⅱ)与DNA的结合效率,最终增强Pt(Ⅱ)的抗肿瘤活性。通过HE初步评价了 CBP-LANPs的体内安全性,与5%的葡萄糖组进行对比,CBP-LANPs治疗后各器官形态均未见可视化组织损伤,安全性良好。综上所述,本文构建了基于四价卡铂的小分子纳米药物CBP-LA NPs。所构建的SMND可有效蓄积于肿瘤部位,被肿瘤细胞摄取后,可竞争性消耗肿瘤细胞内的GSH,保护Pt(Ⅱ)免于GSH的鳌和作用,克服GSH介导的铂类药物耐药性,增加Pt-DNA结合效率,提高铂类药物的治疗效果。
【图文】：

２．２专属性考察结果逡逑将ＤＭＳＯ溶液及ＣＢＰ－ＬＡ的ＤＭＳＯ溶液以２７１邋ｎｍ为紫外检测波长，进行逡逑ＨＰＬＣ进样，，所得谱图为图１邋－５。由图可知，ＣＢＰ－ＬＡ在６．２邋ｍｉｎ出峰，此时ＤＭＳＯ逡逑不出峰，不干扰ＣＢＰ－ＬＡ的含量测定，专属性良好。逡逑Ａ邋ｎＡＪ＂逡逑也逦ＣＢＰ－ＬＡ逡逑．ｎ逡逑４）－逡逑ｉ逦；逡逑Ｉ邋Ｉ邋１邋ｉ邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋！邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋ｉ邋Ｉ邋Ｉ邋｜邋Ｉ邋Ｉ邋Ｉ逡逑０逦２５逦５逦７５逦Ｖ邋１２５邋石邋１７５邋ｍｉｎ逡逑Ｂ邋１邋ｍ逡逑ＤＭＳＯ逡逑８Ｄ－逡逑：逡逑－逡逑Ｊ逡逑。；逡逑逦逦逦逦邋＇￣￣■逦逡逑—ｉ￣ｉ￣￣￣｜￣ｉ￣１邋￣￣１邋￣￣｜￣＞￣￣＇￣１邋￣１邋￣｜￣１邋￣１邋￣１邋￣１邋￣｜￣＇￣１邋￣１邋￣１邋￣｜１邋￣＇￣１邋￣１邋￣｜￣１邋￣１邋￣１邋￣１邋￣｜￣１邋￣—逡逑０逦２５逦５逦７５逦１０逦Ｃ５逦％逦１７５邋ｍｉｎ逡逑图１－５邋（Ａ）邋ＣＢＰ－ＬＡ的ＨＰＬＣ色谱图和（Ｂ）邋ＤＭＳＯ／ＰＢＳ的ＨＰＬＣ色谱图（实逡逑验记录邋０００５１３０，ｐ７０）逡逑Ｆｉｇ．邋１－５邋Ｔｈｅ邋ＨＰＬＣ邋ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ邋ｏｆ邋ＣＢＰ－ＬＡ邋（Ａ）邋ａｎｄ邋ＤＭＳＯ／ＰＢＳ邋（Ｂ）逡逑２．３标准曲线建立逡逑ＣＢＰ－ＬＡ标准曲线测定结果见表１－１。以ＣＢＰ－ＬＡ峰面积（Ａ）为纵坐标，逡逑浓度Ｃ邋（ｐｇ／ｍＬ）为横坐标

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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R943

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本文编号：2636899