鱼藤酮诱导自噬抑制介导神经细胞凋亡分子机理研究

发布时间：2020-04-26 18:45

【摘要】：本研究采用细胞培养、DAPI和MDC染色、RNA干扰、荧光蛋白标记、Western blotting等细胞分子生物学方法和技术,以PC12细胞和小鼠原代神经元为实验对象,综合研究了鱼藤酮对神经细胞自噬水平的影响,并深入探讨了鱼藤酮诱导神经细胞凋亡与自噬抑制的关系。结果如下:1鱼藤酮诱导神经细胞自噬抑制PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染Ad-GFP-LC3的PC12细胞和小鼠原代神经元,以不同浓度鱼藤酮(0-1 μM)处理24 h,或用鱼藤酮(1 μM)处理(0-24 h),观察细胞 GFP-LC3puncta 变化;Western blot 分析 Atg5、P62、LC3 蛋白表达。结果显示:鱼藤酮以浓度和时间依赖地方式诱导细胞GFP-LC3 puncta数量减少,以及LC3-Ⅱ减少和p62表达增加。提示:鱼藤酮引起神经细胞PD模型中自噬抑制。2鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡PC12细胞和小鼠原代神经元、或感染shRNA LC3-Ⅰ/Ⅱ、shRNA Atg5、shRNA GFP、Ad-GFP-LC3的PC12细胞,用不同浓度鱼藤酮(0-1 μM)处理24h、或用雷帕霉素(0.2 μg/ml)预处理2 h后鱼藤酮(1 μM)处理24 h,MDC染色和GFP-LC3荧光拍照评估细胞自噬体变化,DAPI染色分析细胞凋亡,Western blot检测 Atg5、P62、LC3、Cleaved-caspase-3、Cleaved-PARP 表达。结果显示:雷帕霉素逆转鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度降低和凋亡增加;下调LC3-Ⅰ/Ⅱ或Atg5强化鱼藤酮诱导神经细胞MDC荧光强度或GFP-LC3 puncta数量降低以及调亡增加。提示:鱼藤酮诱导自噬抑制导致神经细胞凋亡。
【图文】：

逦第一部分邋文献综述逦ｍ逡逑养条件存在特异性差异和双向作用，或许对自噬流的情况进行片面分析可能导致逡逑错误的结论｜９］。在鱼藤酮的情况下，毒素对自噬流的可变作用可能取决于体内和逡逑体外分析的剂量，持续时间和细胞类型。这种现象可以部分地由ＲＯＳ水平和鱼逡逑藤酮引起的线粒体损伤程度来解释［６２＿６４］。鱼藤酮对神经元存活具有上述的不利影逡逑响，对自噬流产生两面效应。报道鱼藤酮在大多数情况下阻断自噬，因为用山奈逡逑酚或雷帕霉素－强自噬诱导剂处理小鼠－有效地减弱鱼藤酮介导的毒性［６５］。为逡逑进一步支持这一观点，用高剂量的鱼藤酮处理ＳＨ－ＳＹ５Ｙ细胞阻断ＡＴＧ５依赖性逡逑自噬，致使细胞内溶酶体功能紊乱，Ｐ６２蛋白水平增加以及ａ－突触核蛋白的异常逡逑积累１６４１。￣此同时，只心少数研究认为负藤酮是自噬流的诱导因子（图２）。例逡逑如，用鱼藤酮处理ＨｅＬａ细胞会通过上调自嗤和线粒体自噬来引发细胞死亡，这逡逑－过程是由线粒体超氧化物引发的［６６］。此外，在用低剂量鱼藤酮处理的原代皮逡逑

逦第二章细胞自噬及其在神经变性疾病发生中的作用逦１９逡逑自噬期间涉及膜动力学的独特分子组［１８］。在哺乳动物细胞中己经发现了三种类型逡逑的自嗤途径：巨自j（Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ），微自嗤（Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）以及分子伴逡逑侣介导的自嗤（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，ＣＭＡ）邋［１９－２３］，如图邋２－１邋所示丨９］。逡逑＂＂＂＂＂逦＇
【学位授予单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R99

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本文编号：2641782