一种新型胰岛素类似物的生产及活性研究

发布时间：2020-04-27 10:27

【摘要】：目的:Ⅰ型糖尿病是一种以β细胞永久性破坏为特征的糖尿病类型,病人需要终生注射胰岛素,然而注射胰岛素存在很多不足之处:缺乏肝脏特异性,容易引起低血糖症;病人需要频繁的注射,增加了病人的痛苦。转铁蛋白融合蛋白技术被广泛的应用于蛋白质药物的生产,例如,胰岛素原转铁蛋白融合蛋白(ProINS-Tf)已被研究者通过HEK293细胞成功表达,经实验证明其同时具备肝脏特异性和长时降血糖的作用。为了提高产量,本研究尝试利用大肠杆菌诱导表达ProINS-Tf并检测其活性。在此基础上为了进一步提高产量,我们通过分子生物学手段去除转铁蛋白的C端序列,进行诱导表达及纯化,比较两种重组蛋白的产量及活性,从而为一种新型的胰岛素类似物的工业化生产奠定一些基础。方法:设计并合成重组质粒pET28a/Pro INS-Tf,在此基础上设计引物进行PCR获得Pro INS-NTf的序列,通过酶切连接入pET28a表达载体获得重组质粒pET28a/ProINS-NTf以表达ProINS-NTf,将两种质粒转化入BL21(DE3),利用IPTG诱导表达重组蛋白,经镍柱亲和层析纯化获得高纯度的重组蛋白。通过向链脲佐菌素(STZ)诱导的I型糖尿病小鼠注射纯化后的两种重组蛋白以检测其活性。结果:两种重组质粒转化入BL21(DE3)后分别诱导表达出分子量为90kDa和50kDa的目的蛋白,均以包涵体形式表达。经过变性和复性后,ProINS-Tf和ProINS-NTf重组蛋白转变成了可溶形式,经镍柱亲和层析纯化后得到了较高纯度的重组蛋白。向STZ诱导的I型糖尿病小鼠皮下注射纯化后的ProINS-Tf(67.5nmol/kg)和Pro INS-NTf(67.5 nmol/kg),注射Pro INS-Tf(67.5 nmol/kg)组的小鼠血糖缓慢下降并长时间的维持在低水平,注射ProINS-NTf(67.5 nmol/kg)组的小鼠血糖下降不明显。结论:1:pET28a-Pro INS-Tf/BL21能够高效表达Pro INS-Tf,经过变性,复性和纯化后得到了高纯度且有生物学活性的目的蛋白;2:ProINS-NTf不具有和ProINS-Tf一样的降血糖活性。
【图文】：

图 1-1 pET28a-ProINS-Tf 表达载体图谱Fig.1-1 The map of pET28a-ProINS-Tf plasmidProINS-Tf 重组蛋白的表达合成的 pET-ProINS-Tf 重组质粒 10 ng 转化入 50 μL 大肠杆

图 1-4 不同浓度的尿素溶解 ProINS-Tf 包涵体: 蛋白 marker；1-7：3-9M 尿素溶解 ProINS-Tf 包涵体；8:ProINS-Tf 包涵g. 1-4 ProINS-Tf inclusion bodies dissolved with different concentrations of M: protein molecular weight standard; lane 1-7: 3-9M urea dissolved ProINS-inclusion body lane8: ProINS-Tf inclusion body
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R914

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本文编号：2642164