肿瘤微环境响应性纳米药物的构建及高效靶向转运特性研究

发布时间：2020-04-27 11:23

【摘要】：靶向治疗是肿瘤治疗中最具前景的研究方向之一。纳米药物载体因能改善某些药代动力学性质,使药物更好地发挥疗效,在肿瘤靶向治疗方面有着广阔的应用前景。纳米药物载体不仅可通过高通透和滞留(enhanced permeability and retention,EPR)效应实现被动靶向,还可通过在纳米粒表面连接特定抗体或配体实现主动靶向。纳米药物载体的一些理化性质,对于纳米药物在体内的分布、渗透、细胞内化等具有重要的影响作用。表面PEG化是目前纳米药物载体最为常见的修饰方法,可以有效改善药代动力学、降低非特异性作用、延长体内循环时间。然而,表面PEG化会降低肿瘤细胞对纳米药物的摄取作用。由于细胞膜带负电荷,正电性的纳米药物相对比较容易被肿瘤细胞摄取,但也容易被网状内皮系统识别、吞噬,显著降低药物的生物利用度;而负电性或中性的纳米药物,虽有望实现在体内的长循环,但在静电斥力的作用下不易被细胞摄取。细胞穿膜肽(CPP)是一类能够携带多种物质(从纳米粒到小分子化合物、大片段DNA)进入细胞的短肽,具有细胞膜亲和性高、穿膜速度快、可迅速被降解等特点;然而,其缺乏选择特异性,对正常细胞也具有很强的穿膜作用,易导致严重的毒副作用。因此,如何解决这些矛盾问题对于提高纳米药物的抗肿瘤活性具有重要意义。近年来,“刺激-响应”性纳米药物载体获得了越来越多研究者的关注。随着对肿瘤微环境研究的深入,人们发现肿瘤组织由于细胞生长失控、基因表达异常等特点,表现出与正常生理组织显著不同的生理特征,如低pH值、高表达某些酶、高度还原细胞内环境、乏氧、高水平活性氧(ROS)、高浓度三磷酸腺苷(ATP)等。因此,针对肿瘤组织这些独特的生理结构和代谢特征,设计肿瘤微环境响应性纳米药物载体,有望解决以上传统纳米药物存在的矛盾问题,同时达到或增强特定的功能,例如:聚乙二醇(PEG)屏蔽/去屏蔽、表面电荷翻转、细胞穿透肽保护/脱保护、药物的控制释放等。本论文基于肿瘤微环境低pH及肿瘤细胞外高表达基质金属酶MMP2,制备了多种“刺激-响应”性纳米药物,以期延长体内循环、增强渗透、提高细胞摄取、控制药物细胞内特异性释放及逆转肿瘤细胞多药耐药性,从而提高药物抗肿瘤活性。具体包括以下三部分工作:第一部分pH敏感电荷翻转型纳米接枝物DOX/HDPEPM制备及高效入胞研究β-聚苹果酸(poly(β-L-malic acid),PMLA)是一种以苹果酸为唯一单体的脂肪族聚酯,其具有良好的水溶性、可降解性和生物相容性。在生理条件下,PMLA可降解为苹果酸并进入三羧酸循环,最终生成水和二氧化碳,因此其在体内不会引起免疫原性,亦不会带来蓄积毒性。另外,PMLA结构规整,具有许多活性基团(每一个结构单元含一个羧基),可同时键合多种功能分子,包括:药物、靶向配体、荧光染料等,从而实现多重功能作用。因此,PMLA被认为是一种潜在且具良好应用前景的聚合物药物载体。这一部分工作中,我们将多种功能基团同时接枝于PMLA骨架上,制备了一种抗体介导和具有pH敏感电荷翻转特性的多重功能纳米接枝物,以实现肿瘤细胞对药物高效摄取。当pH由7.4降低为6.8时,该纳米接枝物具有显著电荷翻转特性,Zeta电位由-11.62 mV变为9.04 mV。抗体介导和载体响应肿瘤微环境电荷翻转形成的表面正电荷可以协同促进纳米接枝物的入胞,且载体表面正电荷促进入胞的作用优于抗体介导,两种方式同时修饰可以使纳米接枝物具有更好的抗肿瘤活性。第二部分双重pH敏感纳米复合物PMLA-PEI-DOX-TAT@PEG-DMMA制备及高效入胞和药物控释研究PMLA表现出良好药物载体的诸多优势,然而,其悬挂羧基所产生的强电负性则会在一定程度上抑制它的入胞效率。在第一部分工作中,DOX是直接通过酰胺键连接到PMLA上,尽管其药物的释放具有pH依赖性,但释放出来的药物不一定是游离药物,有可能是因为PMLA的水解,从而导致药物的释放,因此,释放出来的药物有可能是连着PMLA分子片段的DOX前药,从而影响药效的发挥。第一部分研究结果表明,载体表面正电荷促进入胞的作用优于抗体介导。另外,主动靶向受限于肿瘤异质性和特殊的微环境,不具备广泛适用性。因此,我们考虑对第一部分研究中的纳米接枝物进行优化,制备出一种功能更强且更具广泛适用性的抗肿瘤纳米药物载体。在这部分工作中,我们引入细胞穿膜肽TAT以进一步提高细胞摄取效率,通过pH敏感键将DOX连接到PMLA上,制备了一种具有双重pH敏感特性的纳米复合物。纳米接枝物自组装得TAT修饰、带正电性的聚合物胶束,通过静电吸附作用,pH敏感PEG-DMMA包被聚合物胶束PMLA-PEI-DOX-TAT,形成纳米复合物PMLA-PEI-DOX-TAT@PEG-DMMA,实现PEG化、屏蔽正电性及保护TAT的作用。在生理条件下,纳米复合物呈负电性,实现体内长循环,通过被动靶向在肿瘤部位富集。该纳米复合物同时对肿瘤细胞外及胞内溶酶体/内涵体酸性环境敏感,实现两种pH响应:在肿瘤胞外酸性环境下,β-羧基酰胺化基团解离,PEG-DMMA发生电荷翻转,使得体系静电斥力增加,纳米复合物解体,暴露出TAT修饰、正电性的聚合物胶束PMLA-PEI-DOX-TAT,实现高效入胞;纳米载体上酸敏连接键响应胞内酸性环境,使药物在胞内特异性快速释放。小鼠活体荧光成像研究表明正电性的纳米药物易被肝肾识别、捕获,从而无法在肿瘤部位富集,对正电性屏蔽和载体PEG化则可通过EPR效应有效实现被动靶向。体内外抗肿瘤实验结果证实该纳米复合物有很好的抑制肿瘤生长和抗肿瘤效果,且对正常组织没有产生明显毒副作用。第三部分pH与酶双重响应性纳米复合物ZnO-DPPG/DOX@PEG-pp-PE制备及克服肿瘤多药耐药性研究氧化锌纳米粒(ZnO),是一种被美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准的药物赋形剂,因其良好的稳定性、生物相容性和安全性,被广泛应用于药物制剂和化妆品中。近年来,ZnO纳米粒也被开发用作药物载体以递送各种活性分子,包括药物、基因、蛋白和显影剂等。在酸性环境中,ZnO纳米粒会被溶解,具有pH敏感特性,因此,它们被越来越多的研究者用作pH敏感纳米载体,以实现肿瘤靶向药物递送及控制药物细胞内释放。ZnO纳米粒还具有光催化和光氧化能力,相关研究表明,它们可以通过产生氧化自由基、超氧负离子和羟基自由基,杀死肿瘤细胞。因此,ZnO纳米粒不仅可以用作药物载体,同时还具有作为一种抗癌药物的潜力。此外,作为纳米药物载体,ZnO纳米粒可以一定程度上抑制MDR肿瘤细胞外排泵的作用,同时,相关报道表明,ZnO纳米粒还可以上调凋亡促进蛋白Bax的表达,并下调凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达,从而使MDR肿瘤细胞恢复或提高对抗肿瘤药物的敏感性,增强药物的抗肿瘤活性。因此,ZnO纳米粒可以同时克服两种耐药机制:“外排泵”耐药和“非泵”耐药。本研究中,我们通过对ZnO纳米粒进行改性修饰,制备了一种pH与酶双重响应性纳米复合物,用于抗肿瘤药物盐酸阿霉素的靶向递送,同时克服肿瘤细胞多药耐药性,提高药物抗肿瘤活性;将ZnO/DOX包裹在MMP2酶敏感的聚合物PEG-pp-PE形成的胶束核内,形成纳米复合物ZnO-DPPG/DOX@PEG-pp-PE,可以降低ZnO/DOX非特异作用,延长体内循环时间,并提高肿瘤靶向作用能力。细胞内摄和毒性实验表明ZnO/DOX能够有效克服肿瘤细胞多药耐药性,促进药物入胞,胞内ZnO纳米粒响应酸性pH环境而溶解,释放出DOX,发挥抗肿瘤作用;耐药细胞三维多细胞球实验表明ZnO/DOX可以将药物带入多细胞球内部,显著提高渗透性。ZnO-DPPG/DOX@PEG-pp-PE表现出显著的MMP2敏感细胞摄取、三维多细胞球内渗透及抗肿瘤活性。
【图文】：

时间轴,药物,偶联剂

目前，已有一些毒性肽-药物偶联剂处于临床试验阶段，但是，由于一些原因，如半衰期短，这类药物尚未被 FDA 批准上市。不论是抗体还是小分子肽，其与药物之间的连接必须在血液运输过程中保持稳定，同时保证药物对正常组织无活性；而在靶细胞部位，其必须能够在胞外或者胞内被有效切断，释放出活性抗癌药物30,31。这对药物偶联剂的设计和制备提出了很高的技术要求。2 纳米药物用于肿瘤治疗随着近几十年来技术的不断发展，纳米医学在肿瘤临床诊断和治疗中做出了许多重要贡献。其中，能够靶向肿瘤的纳米药物载体成为研究的热点（图 1）。与传统化疗药物相比，纳米药物载体在药物运输方面表现出诸多优越性：①提高药物的水溶性及体内外稳定性，增强药物的吸收率和生物利用度；②靶向药物转运，增加药物疗效，减少毒副作用；③实现药物的缓、控释放，延长药物的作用时间；④药物联合转运，实现协同治疗作用及克服多药耐药性等。

药物载体,纳米药物

巴细胞的活性；然而，经 PEG 修饰后的脂质纳米囊，则不会诱发任何免疫细活性。因此，纳米药物表面 PEG 化可以有效地逃避吞噬细胞的识别与吞噬，提高其转运效率。然而，表面 PEG 化对纳米药物的细胞摄取也会产生一定的影响，会降低细纳米药物的胞吞作用77。相关研究表明，，PEG 的链长对细胞摄取的影响作用，而纳米药物表面 PEG 覆盖率及构型对细胞摄取有较大影响。为了克服这一，许多研究者设计了响应性 PEG 链或 PEG 层屏蔽/去屏蔽的策略，从而增强药物的细胞摄取78-80。聚合物纳米药物载体由聚合物所形成的纳米药物载体因其优良的特性，如生物相容性和可降解性广泛应用于癌症治疗领域。它们可以大致分为四种类型，即聚合物胶束、聚纳米粒、树状高分子聚合物和聚合物-药物接枝物。（图 2）
【学位授予单位】：中国人民解放军空军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R943

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