基于万古霉素和原卟啉的高分子抗菌剂对病原菌的鉴定和灭活

发布时间：2020-04-30 19:00

【摘要】：细菌感染导致严重的健康问题,危害人类的生命安全,特别是由革兰氏阳性菌引起的感染可引起多种严重疾病,例如败血症、菌血症、肺炎、骨髓炎和心内膜炎等。从1942年发现青霉素至今,先后就有近20类上百种抗菌药物应用于临床,在治疗感染,控制细菌性传染病流行等方面发挥了积极作用。但是,由于细菌敏感性变迁,临床不合理使用抗生素等导致多重耐药菌(MDR)的出现,并且由MDR所引起的细菌感染死亡率逐年上升,使得感染性疾病的治疗与控制面临极大的挑战。此外,快速准确地鉴别病原体类别,对症下药,既可以提高救治重症细菌感染患者的成功率,也可以避免抗生素的滥用从而导致细菌耐药现象的发生,在临床治疗细菌感染方面具有重要的意义。荧光标记检测技术检测灵敏度高、速度快,在细菌鉴定方面具有广阔的应用前景。带有荧光功能的抗菌剂既能够通过荧光技术鉴定细菌,又能够成功灭活它们。因此,设计与合成荧光抗菌剂能够为日益严峻的细菌感染问题提供诊疗手段。基于上述研究目标,本文合成两种带有荧光功能的抗菌剂,通过抗菌剂携带的官能团与细菌作用进行细菌成像和鉴定,以及灭活。主要研究内容涵盖以下两部分:1.万古霉素修饰的聚噻吩用于革兰氏阳性菌的鉴定和灭活:水溶性聚噻吩是一种重要的荧光共轭聚合物,而万古霉素能与革兰氏阳性菌细胞壁上的D-丙氨酸-D-丙氨酸(D-Ala-D-Ala)单元相结合,达到靶向作用功效。在这项工作中,作者采用Fe~(3+)催化氧化聚合法制备了一种含活性五氟苯酯(PFP)的活性聚噻吩衍生物。该聚合物与万古霉素以及α-甲氧基-ω-氨基聚(乙二醇)(mPEG-NH_2)通过氨基-活性酯反应,制备具有良好水溶性且能发出荧光的万古霉素修饰的聚噻吩(PTPVan)。为了检查结合万古霉素的PTPVan是否能抑制革兰氏阳性菌的生长,本工作首先评价了PTPVan的抗菌性能。因为万古霉素能够选择性识别革兰氏阳性菌,本工作还通过肉眼、荧光光谱法以及共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)观察了细菌与PTPVan孵育后细菌颜色和荧光变化情况。上述研究结果显示PTPVan对革兰氏阳性菌有抑制生长的作用且能选择性识别革兰氏阳性菌。2.水热衍生的原卟啉纳米颗粒用于细菌的成像和灭活:原卟啉(PPIX)是一种常见的光敏剂(PS),能够发射出红色荧光,在可见光或近红外光照射情况下能产生活性氧自由基(ROS),所产生的ROS可用于光动力抗菌化学疗法(PACT)。聚乙烯亚胺(PEI)是水溶性高分子,带有正电荷,可以增强光敏剂与细菌的作用。本项工作中,作者采用简单的水热法,利用PEI与PPIX之间的酰胺化作用制备含有丰富氨基和原卟啉基团的原卟啉纳米颗粒(PPIX-PEI NPs)。利用X射线光电子能谱、紫外-可见吸收分光光度计、荧光分光光度计、粒度/Zeta电位仪和透射电子显微镜对PPIX-PEI NPs的粒径、形貌、表面电位、光学性能和化学结构进行表征。通过最低抑菌浓度实验(MIC)和生长曲线实验测试PPIX-PEI NPs的抗菌性能,PPIX-PEI NPs对E.coli、P.aeruginosa、S.aureus和S.epidermidis四种细菌的MIC值分别为850,212.5,425和26.6μg/mL。结果显示:PPIX-PEI NPs对革兰氏阳性菌和阴性菌均有抑制作用。在635 nm激光照射下,低于MIC浓度(10μg/mL)的PPIX-PEI NPs产生ROS,能够完全抑制革兰氏阳性菌的生长。由此可知PPIX-PEI NPs对革兰氏阳性菌存在光动力协同抗菌活性。此外,PPIX-PEI NPs发射出的红色荧光有助于通过流式细胞仪和CLSM识别不同种类的细菌。
【图文】：

基本过程

图 1.2 PCR 扩增反应的基本过程取材可以是病理生理标本，如细胞、血液、羊水细胞真菌等病原体标本。PCR 技术在临床医学检验中最具病。PCR 技术在诊断感染性疾病中的应用解决了免疫判断疾病是否处于亚临床或隐性状态提供依据。但该方行，所需仪器多，耗时长，操作复杂，复杂的实验过果，假阳性偏高[22]。R）的发展已经有 50 多年的历史。NMR 的原理主要是在外加恒定磁场的作用下原子核能级会产生分裂，用激发自旋系统，当电磁波能量与能级差相同时，原子产生共振吸收信号。NMR 技术由于具有检测速度快、，使其在物理、化学、生物、地质、计量以及医学等[23, 24]。

原理图,有机荧光染料,罗丹明6G,荧光标记

了它们的广泛应用。荧光标记检测技术标记检测技术可分为有机染料标记细菌检测技术和包裹有机荧光染标记细菌检测技术。有机染料标记细菌检测技术：常用于标记细菌荧光素类[31]，菁染料[32]，罗丹明类[33]等。其中，有机染料标记可分直接连接和对细菌核酸进行标记两种标记模式。最早使用荧光标记荧光素，荧光产率较高，但容易发生猝灭，通常与生物分子进一步稳定性。罗丹明类的稳定性优于荧光素，，不易光降解，但是罗丹明性差，在生化领域的应用受到限制。异硫氰酸荧光素与罗丹明 6G 的，Wang 课题组[34]使用在中性溶液中带正电荷的罗丹明 6G，成功地coli（图 1.3），B. subtilis 和 S. aureus 等细菌进行荧光检测。常应用于行标记的有机染料主要有菁染料，吖啶橙（AO），SYTO 染料[35]，S 染料[36]以及 SYTOX 染料等。这些染料与细菌 DNA 作用后，荧光强从而实现细菌的检测[37]。
【学位授予单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R978

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