枯草芽孢杆菌溶栓酶的分离纯化及性质研究

发布时间：2017-03-25 01:11

  本文关键词：枯草芽孢杆菌溶栓酶的分离纯化及性质研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：血栓类疾病是威胁人类生命健康的头号杀手。血栓形成后会对脑、心脏、肺等血液循环系统造成栓塞,从而导致多种疾病,如冠心病、脑血栓、动脉硬化等。血栓性疾病由于其致残、致死率非常高,所以一直是医学领域研究的重点和难点。血栓性疾病的发病与年龄相关,随着我国老龄化问题的日益严重,血栓类疾病的预防和治疗显得尤为重要。溶栓是血栓类疾病最有效、应用最广的治疗与预防方法之一。通过溶栓药物的应用以达到溶解治疗血栓的目的。目前临床上应用的主要溶栓药物有尿激酶(UK)、链激酶(SK)和组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)等。这些溶栓药物虽然溶栓效果明显,但依然存在半衰期较短、价格昂贵等缺点,所以仍需要寻找疗效好、安全、经济的溶栓药物。溶栓酶广泛来源于动物、植物和微生物。微生物作为溶栓酶药物的来源,具有培养容易、产量高、所需设备简单等优点,一直都是溶栓药物研究开发的一个重点。本研究在实验室前期工作的基础上,对枯草芽孢杆菌发酵液中的溶栓酶进行分离纯化。建立了硫酸铵盐析、离子交换层析的纯化方法,制备了较纯的枯草芽孢杆菌溶栓酶。研究了酶的稳定性及降解特异性。在此基础上,初步研究该酶在动物体内的溶栓活性。研究结果如下：1.纯酶样品的制备：将发酵液用60%饱和度的硫酸铵进行盐析,离心收集蛋白沉淀,溶解后,在醋酸盐缓冲液(0.02 M pH 5.6)中透析。样品透析后经阳离子交换层析(CM-sepharose Fast Flow)进行进一步分离纯化,制得纯化酶制品。通过蛋白质电泳(SDS-PAGE)和酶活检测,评价与检测纯化过程中溶栓酶组分的纯度及活性。2.稳定性及降解特异性研究：在不同温度(4℃、37℃)下,研究该酶在溶液状态下的稳定性。结果发现,在4℃条件下,酶活在9天的降解实验中保留了90%的活性。而在37℃条件下,在9天降解实验中,其酶活在前3天迅速下降,5天后基本没有检测到酶活。说明该酶在4℃条件下具有较好的稳定性。此外,通过纤维蛋白“加热”平板实验,发现该酶具有直接降解纤维蛋白的能力。3.体内溶栓活性的初步研究：初步的体内溶栓研究表明,该酶在体内具有较强的溶栓效果。该酶通过股静脉注射40分钟后,取实验动物血液,待血液凝固后,药物注射组仍具有良好的溶解血栓能力,显微镜下观察红细胞形态完整,溶解血栓能力与酶浓度呈正相关。
【关键词】：枯草芽孢杆菌 溶栓酶 分离纯化 稳定性 溶栓
【学位授予单位】：中国海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R914
【目录】：

• 摘要5-7
• Abstract7-12
• 1. 前言12-26
• 1.1 枯草芽孢杆菌简介及其应用12-15
• 1.1.1 枯草芽孢杆菌简介12
• 1.1.2 枯草芽孢杆菌的应用12-15
• 1.2 血栓疾病概述15-19
• 1.2.1 血栓疾病的分类及其危害15-16
• 1.2.2 血栓的成因及其分子机理16-19
• 1.3 血栓疾病的治疗方法19-20
• 1.4 抗血栓药物的发展20-24
• 1.4.1 抗血小板类药物20
• 1.4.2 抗凝药物20-21
• 1.4.3 溶栓药物21-24
• 1.5 微生物来源的溶栓酶类24-25
• 1.5.1 芽孢杆菌产生的纤溶酶24
• 1.5.2 链霉菌产生的纤溶酶24-25
• 1.5.3 根霉产生的纤溶酶25
• 1.5.4 海洋假单胞菌产生的纤溶酶25
• 1.6 立题依据及研究意义25-26
• 2. 枯草芽孢杆菌溶栓酶的发酵及分离纯化26-35
• 2.1 引言26
• 2.2 实验材料、试剂与仪器26-27
• 2.3 实验方法27-31
• 2.3.1 溶栓酶粗酶液的制备27-28
• 2.3.2 溶栓酶酶活的测定28
• 2.3.3 盐析曲线的制作28-29
• 2.3.4 溶栓酶的纯化29-30
• 2.3.5 溶栓酶蛋白含量的测定30-31
• 2.3.6 SDS-PAGE检测蛋白质纯度及大致分子量31
• 2.4 实验结果31-34
• 2.4.1 溶栓酶粗酶的提取31-32
• 2.4.2 溶栓酶的纯化结果32-34
• 2.5 讨论34-35
• 3. 溶栓酶稳定性及降解特异性研究35-43
• 3.1 引言35
• 3.2 材料、试剂及仪器35-36
• 3.3 实验方法36-37
• 3.3.1 溶栓酶溶解纤维蛋白研究36-37
• 3.3.2 不同温度下(4℃、37℃)溶栓酶9天降解实验37
• 3.4 实验结果37-41
• 3.4.1 溶栓酶溶解纤维蛋白的研究结果37-39
• 3.4.2 4℃条件下溶栓酶9天降解实验结果39-40
• 3.4.3 37℃条件下溶栓酶9天降解实验结果40-41
• 3.5 讨论41-43
• 4. 溶栓酶体内溶栓性质初步研究43-54
• 4.1 引言43
• 4.2 实验材料、试剂及仪器43-44
• 4.3 实验方法44-45
• 4.3.1 实验材料、组别及剂量44
• 4.3.2 实验流程44
• 4.3.3 指标的观察与分析44-45
• 4.4 实验结果45-53
• 4.4.1 右股静脉注射给药后大鼠状态变化45-46
• 4.4.2 不同组别凝血时间的差异46
• 4.4.3 不同时间点下血块变化情况46-49
• 4.4.4 游离红细胞数及红细胞形态观察49-52
• 4.4.5 血块剩余情况52-53
• 4.5 讨论53-54
• 5. 全文总结54-55
• 论文的创新点55
• 论文的不足之处55-56
• 参考文献56-63
• 中英文缩略语对照表63-64
• 致谢64-65
• 个人简历65

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